重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用MutS表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油-甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g/L,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol/L时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol/L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol/L以上,血管生长抑制素的表达产量达到108mg/L。     

两阶段控制甘油浓度提高1,3-丙二醇发酵水平

克雷伯氏菌(K lebsiella pneum on iae)分批发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD),根据菌体生长、产物生成和补料可将发酵过程分成4个阶段。不同阶段控制不同的底物浓度会对菌体生长和产物生成产生不同的影响。研究发现,菌体生长阶段(阶段II)底物浓度控制在6.0 g/L最适合菌体生长,产物主要生成阶段(阶段III)底物浓度控制在18.9 g/L最适合产物生成,菌浓可达7.83 g/L,最终1,3-PD的浓度为68.5 g/L,摩尔转化率为61%,生产强度为2.21 g/(L.h)。     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

卡拉胶固定化Nocardia sp.生产L(+)酒石酸

采用卡拉胶包埋具有环氧琥珀酸水解酶活性的诺卡氏菌菌体用于生产酒石酸。固定化的最适卡拉胶浓度为20 g/L,菌体浓度为200 g/L,交联剂戊二醛浓度为5 g/L,固定化后的酶活回收率可以达到70%。高浓度的环氧琥珀酸对水解反应产生抑制作用,游离细胞的米氏常数(Km)为0.234 m o l/L,抑制常数(KI)为0.22 m o l/L,固定化细胞则分别为0.31 m o l/L和0.21 m o l/L。游离细胞和固定化细胞反应的最适pH分别为8.0和8.5。细胞固定化以后,耐热稳定性增强。30°C 0.2m o l/L的底物浓度下,摇瓶中连续转化25批,L(+)酒石酸的转化率接近100%。     

葡萄糖酸钙对肌苷发酵的影响

在肌苷的摇瓶发酵过程中,10 g/L的葡萄糖酸钙适于肌苷的合成和菌体生长。初始培养基中加入10 g/L的葡萄糖酸钙,能够诱导葡萄糖酸激酶的生成,大幅提高其比活,增大磷酸戊糖(HM P)途径的通量。肌苷的产率由10.76 g/L提高到18.36 g/L。     

白蜡多年卧孔菌发酵培养条件优化的研究

对白蜡多年卧孔菌最佳发酵培养条件进行了探索,其摇床发酵最优培养条件为:葡萄糖37.7 g/L,酵母粉8.3 g/L,磷酸二氢钾6.31 g/L;培养温度30℃,500 mL三角瓶装液量200 mL,初始pH值为6,摇床转速180 r/min,10%接种量培养7 d,最大产量达到15.46 g/L.发酵罐最优培养条件为:葡萄糖37.7 g/L,酵母粉8.3 g/L,磷酸二氢钾6.31 g/L,培养温度30℃,装液量6 L/10 L,初始pH为6,搅拌速度380 r/min,10%接种量培养120 h,最大产量达到19.47 g/L.     

利福霉素高产菌株快速筛选方法的建立及应用

利福霉素发酵过程中pH变化规律能够反映菌体对不同营养物质的利用情况及菌体生理特性的变化,并与最终放瓶效价有一定的关联。据此建立了一种以发酵前期(±50 h)pH变化为判断依据的新的快速筛选菌种的方法,即发酵前期pH下降到谷底较早的菌株高产的可能性很大(概率接近70%),并在双亲株灭活种间融合法选育利福霉素SV菌株中进行了应用,筛选到了高产融合菌株F-3及F-16,两菌株分别比出发菌株效价提高了11%和17%。同时,得到了两个亲株(利福霉素SV产生菌U-32、利福霉素B产生菌X#-1)的酶解条件(U-32:10 m g/mL、34°C、2 h;X#-1:10 m g/mL、34°C、3 h)及原生质体双灭活标记条件(U-32:UV 20 m in;X#-1:60°C、50 m in),双灭活原生质体用500 g/L PEG融合,融合频率约1.04×10-5。     

基因工程菌Pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学

在同一稀释率μ(μ=0 .1 4h-1)下用不同浓度的甘油流加进行连续培养 ,研究甘油浓度对基因工程菌毕赤酵母 ( Pichia pastori)生长的影响。结果表明甘油浓度对细胞生物量 ( DCW和WCW)、底物得率系数 ( YX/ S)、底物比消耗速率 ( qs)、呼吸熵 ( RQ)与二氧化碳释放率 ( CER)都有影响 ,在低甘油残留浓度 ( <63.3g/L)下 ,甘油是激活剂 ,菌体生长符合 Monod方程 ,Ks=1 9.62 g/L,甘油激活常数 Ka=1 9.45 g/L;而在高甘油残留浓度 ( >63.3g/L )下甘油是抑制剂 ,菌体生长特征符合 Haldance方程 ,Ks=0 .0 1 4g/L,KI=1 5 6.67g/L。毕赤酵母生长的甘油抑制浓度为 5 5 .42 g/L     

阿维菌素发酵过程参数相关特性研究及过程优化

微生物发酵是一个复杂的生物过程,通过对阿维菌素发酵过程中反映菌体代谢的在线参数,如OUR、CER、RQ、DO、pH以及离线参数的相关性分析,根据分析结果对发酵过程工艺进行优化,提出在发酵后期根据RQ确定碳源补加时机、根据过程pH确定碳源补加速率,使阿维菌素的发酵单位从国内平均水平3.8 g/L提高到了5.05 g/L。     

基因替换及多基因共表达强化大肠杆菌辅酶Q_(10)的合成能力

为了强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力,对大肠杆菌进行了相关的基因操作。通过敲除大肠杆菌染色体上的聚八异戊二烯焦磷酸合成酶基因ispB,并导入来自Gluconobactersuboxydans的聚十异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA,使大肠杆菌具有CoQ10合成能力的同时降低了内源性辅酶Q8(CoQ8)的合成。采用双质粒共表达系统,对CoQ生物合成途径中多个功能基因进行了强化表达,构建得到的重组大肠杆菌CoQ的合成能力、CoQ10合成的专一性都有明显改善,其中ubiCA和ddsA基因的协同表达效果最为明显,CoQ的合成能力比对照提高了65%,而CoQ10的合成量也提高了1.1倍。     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

D-核糖发酵过程中的pH控制及对产D-核糖关键酶的影响

在枯草芽孢杆菌突变株D-756发酵生产D-核糖过程中,采用葡萄糖和葡萄糖酸钙混合发酵,葡萄糖酸作为pH调节剂,能促进菌体的生长,显著地提高D-核糖的产量。经酶活测定,发现流加葡萄糖酸能提高单位发酵液中葡萄糖酸激酶的酶活。在5 L发酵罐中,利用葡萄糖酸维持发酵pH值在7.2,培养72 h后产核糖76.8 g/L。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

固定化诺卡氏菌批次连续转化生产L(+)酒石酸

采用卡拉胶包埋具有环氧琥珀酸水解酶活性的诺卡氏菌用于生产L(+)酒石酸。为了提高细胞固定化的效率,采用自制的固定化装置,将固定化细胞制成细条状,可以加快固定化细胞的制备,获得具有高活性和强度的固定化细胞颗粒,固定化细胞的最佳菌体浓度为100 g(湿细胞)/L。将固定化细胞用于填充床反应器进行反复批式反应,可以反复利用48次以上,将0.85 mol/L的环氧琥珀酸溶液转化为L(+)酒石酸,酒石酸的得率不低于96%。     

Arthrobacter globiform is酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

Torulopsis glabrata 620在丙酮酸生物合成中的能荷变化和氧化-还原态趋势

建立了用高效液相色谱法同时测定丙酮酸产生菌Toru lop sis g labrata 620中的ATP、ADP、AM P、NAD+和NADH的方法,从而描绘了在整个发酵过程中菌体的能荷变化和氧化-还原态趋势,指出菌体的能荷水平和丙酮酸生物合成密切相关,在菌体的能荷水平降低至0.1时丙酮酸开始大量合成,直至发酵末期能荷水平又重新升高。这为进一步提高丙酮酸的产量、研究Toru lop-sis g labrata中物质与能量代谢的关系奠定了基础。     

诱导条件对重组人锰超氧化物歧化酶发酵的影响

分别研究了3种诱导剂和Mn2+浓度对重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)发酵表达的影响,并进一步优化了乳糖诱导rhMn-SOD表达的条件。结果表明:异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导能够获得类似的表达效果,诱导的同时加入2 mmol/L的Mn2+能够明显提高rhMn-SOD的表达。进一步的实验结果表明:乳糖诱导的最佳浓度为7 mmol/L,最佳时机为接种后6 h,A600为2.1,诱导表达6 h rhMn-SOD活性和比活达到最高。     

mRuby2在原核细胞中的表达及纯化

采用PCR技术扩增mRuby2,将其插入原核表达载体p ET30a(+)中,用p ET30a(+)-mRuby2转化BL21(DE3)并诱导重组蛋白表达,用荧光显微镜及SDS-PAGE观察、检测目标蛋白的表达情况,以Ni亲和层析技术纯化重组蛋白。结果表明:构建的重组表达菌株经IPTG诱导后,发酵液颜色随诱导时间延长逐渐转为橙红,离心后的沉淀菌体为深粉红色,在荧光显微镜下,菌体发出明亮的红色荧光。SDS-PAGE检测发现,IPTG诱导5 h,重组蛋白表达量达到峰值。采用Ni螯合亲和层析技术从发酵菌体中分离出纯度大于80%的重组蛋白。由此可见:采用DNA重组技术能在原核系统中成功表达mRuby2编码的荧光蛋白,该重组蛋白亮度高、可视性好,能直观呈现实验结果,便于观察相关实验现象、理解并掌握实验原理,非常适合于生化、分子生物学实验教学。     

水解玉米穗芯发酵生产SCP试验

采用CandidaboidiniiNo.2 2 0 1的诱变株Y -1 0 8,以玉米穗芯为原料 ,用其水解液发酵培养生产SCP ,试验结果表明 :在玉米穗芯水解液中添加 6%～8%的玉米浆、0 .3 %的尿素或氯化氨、初始 pH值 5.0左右、接种量 1 0 % ,于3 0℃培养 72h的干菌体产量高达 3 0 g/L左右