毛细管电泳定量分析兔血管平滑肌细胞内外源基因RT-PCR产物

目的应用毛细管电泳的方法定量分析体外培养的兔血管平滑肌细胞中外源基因mRNA的表达水平。方法构建兔特异性金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP-3)基因重组质粒载体,通过阳离子脂质体介导转染兔平滑肌细胞;实验分为重组质粒组、空质粒载体组、正常对照组;转染48小时后抽提各组总RNA,按照RT-PCR方法进行扩增;对重组质粒载体进行双酶切,提纯TIMP-3DNA并进行浓度测定,按照已知浓度对其进行毛细管电泳,绘制TIMP-3DNA标准浓度曲线图;对RT-PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳及毛细管电泳,观察结果并依据标准浓度曲线公式计算RT-PCR产物的含量。结果琼脂糖凝胶电泳中,重组质粒组在TIMP-3基因相应的碱基位置出现明显的阳性条带,而其他两组未见明显的条带;毛细管电泳结果显示重组质粒组TIMP-3DNA含量明显高于正常对照组及空载体质粒组,P<0.05,差别具有显著性意义。讨论CE是一种高效的定性定量方法,RT-PCR产物可以用毛细管电泳直接分离定量。