降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

mRuby2在原核细胞中的表达及纯化

采用PCR技术扩增mRuby2,将其插入原核表达载体p ET30a(+)中,用p ET30a(+)-mRuby2转化BL21(DE3)并诱导重组蛋白表达,用荧光显微镜及SDS-PAGE观察、检测目标蛋白的表达情况,以Ni亲和层析技术纯化重组蛋白。结果表明:构建的重组表达菌株经IPTG诱导后,发酵液颜色随诱导时间延长逐渐转为橙红,离心后的沉淀菌体为深粉红色,在荧光显微镜下,菌体发出明亮的红色荧光。SDS-PAGE检测发现,IPTG诱导5 h,重组蛋白表达量达到峰值。采用Ni螯合亲和层析技术从发酵菌体中分离出纯度大于80%的重组蛋白。由此可见:采用DNA重组技术能在原核系统中成功表达mRuby2编码的荧光蛋白,该重组蛋白亮度高、可视性好,能直观呈现实验结果,便于观察相关实验现象、理解并掌握实验原理,非常适合于生化、分子生物学实验教学。     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

大肠杆菌巴豆甜菜碱还原酶基因缺失菌株的构建

报道了体外构建caiA基因缺失的带有卡那霉素抗性基因的5.2kb线状DNA分子,以此转化大肠杆菌JM83和BL21(DE3)株,借助于体内DNA同源重组,定向敲除了大肠杆菌中的巴豆甜菜碱还原酶编码基因caiA。经遗传稳定性实验、聚合酶链反应(PCR)以及Southern鉴定,表明所获得的JM83转化子22号和BL21(DE3)转化子4号确为caiA基因缺失突变株;酶活分析结果表明,22号和4号转化子均丧失了巴豆甜菜碱还原酶活性。     

东亚飞蝗pSMC重组抗原表达及多克隆抗体制备

采用生物信息学方法对pSMC抗原特性进行分析;利用DNA重组技术构建pSMC_(249-383)重组表达菌株;以Ni亲和层析技术纯化重组pSMC_(249-383)蛋白;用重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠,制备Anti-pSMC多克隆抗体;采用免疫荧光法检测pSMC在血细胞中的定位。将p SMC编码区249-383区段插入pET30a(+),成功构建了pSMC_(249-383)原核表达菌株;用表达、纯化获得的重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠成功获得了高效价的Anti-pSMC多克隆抗体;免疫荧光检测显示pSMC在东亚飞蝗血淋巴吞噬细胞高表达,定位于细胞核,为研究pSMC功能奠定了基础。     

Arthrobacter globiform is酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

抗HPV16E6全蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备特异性识别HPV16E6蛋白的单克隆抗体,为建立HPV早期诊断试剂盒提供有效试剂,通过细胞融合、间接ELISA方法筛选阳性克隆、多次亚克隆得到稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,体内诱生法大量制备腹水,过UNOsphere SuPrA~(TM)柱和ENrich~(TM)SEC650分子筛柱纯化,通过蛋白电泳鉴定其纯度并测定抗体浓度,并采用Western Blot法和间接免疫荧光法验证纯化后HPV16E6抗体与HPV16型阳性Caski细胞和HPV18型阳性Hela细胞特异性结合。建立了亚型为IgG2a的单克隆HPV16E6-4D4杂交瘤细胞株,两步纯化后得到纯度较高的抗体,可特异性识别HPV16型阳性的Caski细胞中的E6蛋白,不与Hela细胞反应,为在蛋白水平上检测HPV16型病毒提供了新手段。     

杆状病毒核心基因ac78的克隆、表达与活性研究

杆状病毒核心基因ac78在杆状病毒的生活周期中具有重要作用。生物信息学分析发现,Ac78与斯氏假单胞菌的细胞色素C氧化酶cbb3-型亚基III具有一定的序列一致性,表明Ac78可能具有氧化酶活性,并在氧化还原反应中具有一定功能。用PCR的方法成功扩增得到ac78基因,该基因序列与GenBank上的苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV) ac78基因的核苷酸同源性100%,将其克隆至原核表达载体p QE30,构建了ac78基因原核表达质粒,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/L IPTG和低温诱导下超量表达了可溶性的目的蛋白。使用Ni-NTA Resin蛋白纯化树脂获得了较纯的含有6×His接头的Ac78蛋白,使用纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒测定其细胞色素C氧化酶活性,结果为阴性,表明Ac78可能不具有细胞色素C氧化酶活性。上述研究结果为深入探究Ac78的作用机理打下了坚实的基础。     

葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响

采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLMVL 2EGF]生产人表皮生长因子(hEGF),其中hEGF表达由PL启动子控制并通过phoA信号肽分泌到胞外。实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF的表达和分泌有很大影响。当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g.h)时,hEGF表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196 g/(g.h)时,单位菌体产生的hEGF水平最高(121.6 m g/g),其中分泌至胞外的hEGF占42%。此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF的生产速率。     

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

小金海棠缺铁胁迫相关miR394a的克隆与表达分析

为了研究铁高效植物小金海棠的miRNAs信息及在缺铁处理下miRNA的表达变化,以进一步了解小金海棠缺铁分子调控机制.以改良CTAB法提取的总RNA为模板,从小金海棠中分离得到miR394a.通过Real-time PCR检测miR394a的表达,并利用生物信息学方法预测了miR394a的靶基因及其功能.miR394a具有高度保守性,从小金海棠中分离的miR394a与其他物种的miR394a序列高度相似.缺铁胁迫后,小金海棠的miR394a在根及叶中都有表达,但表达模式有所不同,miR394a在根部响应较为迅速,缺铁处理1天时,即有上调表达;而在叶片的响应较晚,缺铁3天时有上调表达.miR394a的靶基因预测表明,miR394a主要调控转录因子及参与代谢途径的基因.结果表明,miR394a受缺铁胁迫所诱导,参与了小金海棠缺铁调控途径,在缺铁调控中起重要作用.