通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

杆状病毒核心基因ac78的克隆、表达与活性研究

杆状病毒核心基因ac78在杆状病毒的生活周期中具有重要作用。生物信息学分析发现,Ac78与斯氏假单胞菌的细胞色素C氧化酶cbb3-型亚基III具有一定的序列一致性,表明Ac78可能具有氧化酶活性,并在氧化还原反应中具有一定功能。用PCR的方法成功扩增得到ac78基因,该基因序列与GenBank上的苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV) ac78基因的核苷酸同源性100%,将其克隆至原核表达载体p QE30,构建了ac78基因原核表达质粒,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/L IPTG和低温诱导下超量表达了可溶性的目的蛋白。使用Ni-NTA Resin蛋白纯化树脂获得了较纯的含有6×His接头的Ac78蛋白,使用纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒测定其细胞色素C氧化酶活性,结果为阴性,表明Ac78可能不具有细胞色素C氧化酶活性。上述研究结果为深入探究Ac78的作用机理打下了坚实的基础。     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

人骨形成因子7基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

BMP7是骨形成因子家族的一个成员,它不仅是一个重要的成骨生长因子,而且在糖尿病肾脏损伤保护和逆转中扮演重要的角色。干细胞治疗已经逐渐发展为糖尿病肾病治疗的一种有效手段,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是BMP7的体内天然分泌细胞。本研究旨在通过构建BMP7重组慢病毒表达载体,感染MSCs,并进行鉴定,从而建立BMP7高表达的MSCs细胞系。首先通过PCR法扩增BMP7基因的蛋白编码序列,并克隆入pCDH-BMP7慢病毒载体,其后与包装质粒共转染293T细胞包装病毒,将慢病毒感染小鼠MSCs,荧光显微镜下鉴定感染率。最后,采用定量PCR和Western blot检测BMP7的表达。测序结果表明pCDH-BMP7慢病毒载体构建成功,包装病毒产生的病毒液滴度为5×10~8TU/ml,慢病毒感染小鼠MSCs的转染率高于75%,定量PCR和Western blot结果均显示BMP7表达比对照组显著升高。结果表明BMP7重组慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度滴度病毒液,感染小鼠MSCs能稳定过表达BMP7蛋白,为进一步探索高表达BMP7的MSCs治疗糖尿病肾脏损伤的研究提供实验基础。     

抗HPV16E6全蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备特异性识别HPV16E6蛋白的单克隆抗体,为建立HPV早期诊断试剂盒提供有效试剂,通过细胞融合、间接ELISA方法筛选阳性克隆、多次亚克隆得到稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,体内诱生法大量制备腹水,过UNOsphere SuPrA~(TM)柱和ENrich~(TM)SEC650分子筛柱纯化,通过蛋白电泳鉴定其纯度并测定抗体浓度,并采用Western Blot法和间接免疫荧光法验证纯化后HPV16E6抗体与HPV16型阳性Caski细胞和HPV18型阳性Hela细胞特异性结合。建立了亚型为IgG2a的单克隆HPV16E6-4D4杂交瘤细胞株,两步纯化后得到纯度较高的抗体,可特异性识别HPV16型阳性的Caski细胞中的E6蛋白,不与Hela细胞反应,为在蛋白水平上检测HPV16型病毒提供了新手段。     

真菌诱导型植物表达载体pBP的构建

根据prp1-1启动子序列设计并合成了一对引物,通过PCR扩增的方法从马铃薯基因组中扩增到了病原诱导的prp1-1启动子,并将其克隆到PGEMT-Easy载体上,然后进一步克隆到植物表达载体pBI101.2上,构建了病原诱导型基因表达载体pBP.     

产冷活性淀粉酶嗜冷菌的分离和纯化

文章主要对产冷活性淀粉酶的冷适应微生物进行分离和纯化。通过对菌株的分离和提取基因组DNA进行PCR扩增得到其16S rRNA基因后连接于T—载体再转入大肠杆菌JM109中,筛选阳性克隆转化子进行培养,最后提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。     

一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因,利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明：该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株（HN-HB1-2018、HBHA2015）的核苷酸相似性为98.0%～98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%～90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.     

转AtMYB44基因小麦的获得和检测

为了评价拟南芥转录因子AtMYB44基因对小麦抗病能力的影响,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因作为选择标记,通过基因枪介导法将带有At-MYB44基因的表达质粒AF234296-44导入小麦品种扬麦158.经过2～3次甘露糖筛选后,获得75株再生苗.通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色获得40株CPR阳性再生苗,进一步通过标记基因PMI和目的基因AtMYB44的PCR检测,获得22株PCR阳性植株,转化率为0.306%.结果初步表明AtMYB44基因已整合到小麦基因组中,获得了生物安全标记的转AtMYB44基因小麦.     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

基于自组装及纳米磁球放大的大肠杆菌 O157:H7的压电免疫检测

应用压电免疫传感器快速检测了大肠杆菌O157:H7(E. coli O157:H7).将巯基乙酸(MACA)自组装在AT切向的压电金电极上,以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为反应介质,形成酰氨键固定大肠杆菌抗体.并通过α-甲基丙烯酸(MAA)把抗体修饰在纳米磁球上,采用夹心法将抗原夹在两个抗体间,压电石英晶体交流阻抗(PQCI)和循环伏安法对修饰过程进行了表征,抗原浓度与形成夹心复合物前后的PQCI振动频移相关.其免疫传感器能在3h内检测2×103～8×108 CFU/mL范围内的目标细菌,106CFU/mL情况下重复性实验的RSD在7%以下.     

UFCI基因在乳腺细胞系中的表达分析

泛素结合酶UFC1是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2的基因。目前,对UFC1的功能研究报道还比较少,有待更进一步的研究和探讨。采用半定量RT-PCR技术分别检测一系列的乳腺细胞系MCF7、HBL100、MDA-MB231和MDA-MB-453中UFC1基因的转录水平,结果显示,在正常的HBL100乳腺细胞系中的表达最高,而在乳腺癌细胞系MCF7,MDA-MB231,MDA-MB-453中的表达明显降低。UFC1在乳腺细胞系中的差异表达的结果为将UFC1作为新的靶分子引入乳腺癌的临床预防和治疗提供实验依据。     

ARF基因导入烟草的遗传转化研究

以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS+0.8 mg.L-16-BA+0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS+0.02 mg.L-1IBA+0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中.