甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位.甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础.本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession:JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测.将获得的PGIP基因命名为BoPGIP.该基因DNA全长为1065bp,包含1个内含子和2个外显子.外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26.该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65～68,106～109,130～133,254～257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189～191),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(73～76,78～81,151～154,182～185,304～307)和4个N-豆蔻酰化位点(157～162,188～193,236～241,273～278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79％helix,13.89sheet和54.32％loop,二级结构以无规则卷曲为主.通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础.     

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS24(Ribosomal Protein S24)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫RPS 24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15.3251kD,pI为10.92,含有7种类型共14个功能位点:即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e sig-nature.进一步分析发现,大熊猫RPS 24基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为94.1%、92.4%、94.7%、89.9%和90.4%;与人RPS 24蛋白的氨基酸序列同源性为98.48%,其余均为99.24%.     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cyt b基因的克隆及其比较研究

为揭示2003年在王朗采集的鼢鼠标本王03001号是否为秦岭鼢鼠四川兽类新纪录,以鼢鼠标本王0300号的肌肉组织为研究材料,运用PCR技术对其线粒体Cyt 6基因进行克隆和测序.结果表明该基因的长度为1140bp,编码380个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白质含有2个N-糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,6个N-豆蔻化位点.再以已研究的鼢鼠6个种18个体Cyt b基因序列及氨基酸序列为基础数据,把中华竹鼠(Rhizomys sinensis)作为外群,结合本研究的结果构建系统发育树,所得结果不支持王03001号标本为秦岭鼢鼠.     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.     

人类新基因CHID1的克隆与功能初步研究

使用生物信息学手段,从人公共蛋白质数据库的蛋白质序列中筛选到新的分泌蛋白基因CHID1(Chitinase domain containing 1),该基因定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5),cDNA长1 182 bp,其编码蛋白共有393个氨基酸。转染COS-7细胞后Western blot实验显示:在细胞培养液中没有检测到CHID1蛋白。对CHID1基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现:它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,肝中最高。细胞生长曲线揭示,Lovo-CHID1稳定细胞株有生长抑制的现象,而细胞周期分析发现细胞株在G1期发生阻滞。这表明CHID1有可能是个潜在的抑癌基因。     

人类SSX基因族简介

人类的SSX基因家族包括5个成员:SSXl,SSX2,SSX3,SSX4和SSX5,它们都位于X染色体上.这5个基因有很高的序列同源性:碱基序列有88%-95%同源;所编码188个氨基酸残基构成的蛋白质有77%-91%同源.它们所编码的蛋白质中含有KRAB(Kruppel associated box).SSX蛋白质也是癌/睾丸抗原(CT:Cencer/testis antingns)中的成员.研究SSX基因结构、基因表达等对于肿瘤免疫疗法的建立具有重要意义.     

三角帆蚌一种新型SOD基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆到了一个新型超氧化物歧化酶基因(命名为Hc SODn).Hc SODn基因的长度为1575 bp,包括一个长804 bp的开放阅读框,编码267个氨基酸的蛋白,并含有一个保守的Cu_Zn_SOD结构域.Hc SODn mRNA在所检测的三角帆蚌的各个组织中均有表达,而腮中最高.在嗜水气单胞菌诱导下,血细胞中的Hc SODn mRNA的表达水平在3 h时显著上调(P0.05),表明Hc SODn在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥重要作用.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genesean软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

两株野生型枯草杆菌α-淀粉酶基因的克隆和测序

从土壤中筛选得到两株产α-淀粉酶的枯草杆菌QSH4株和SHX6株.根据枯草杆菌168株的淀粉酶基因设计引物,对QSH4、SHX6株的α-淀粉酶基因进行了克隆及测序.结果表明两株菌的α-淀粉酶基因碱基数目相等,均为1948bp.两者的碱基序列具有99.90%的同源性.QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶基因碱基均较168株酶基因缺失了35 bp(靠近3'-端),另有28个位点的碱基不同,与枯草杆菌168株α-淀粉酶基因之间有96.97%的同源性.由淀粉酶基因测序结果推测QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶蛋白由477个氨基酸组成.与168株的α-淀粉酶蛋白(660个氨基酸)相差183个氨基酸.由此推断酶活性中心可能位于酶分子的N-端的3/4肽段.     

西欧绿绒蒿(Meconopsis cambrica)及其近缘类群ITS基因的序列分析

对西欧绿绒蒿Meconopsis cambrica(L.)Vig.及其它来自罂粟亚科(Papaveroideae)的17个种的nrDNA ITS区(包括ITS1、5.8S和ITS2)的序列进行测定,并对这些序列进行排位和统计分析.所得18个种的ITS序列长度范围为589-676bp,这些序列经ClustalX1.81软件排序后ITS区的序列长度为706位点(ITS1为271bp;5.8S为162bp;ITS2为373bp;包括gap),其中变异位点99个(占14.0%).结果显示,西欧绿绒蒿与绿绒蒿属其它种之间的差异较其与罂粟属(Papaver)的种类之间的差异更大,表明西欧绿绒蒿与罂粟属具有更近的亲缘关系.因此,将西欧绿绒蒿从绿绒蒿属中划分出来并重新归到罂粟属中较为合理.     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolorA3(2),Streptomyces maritimus,Streptomyces mycarofaciensATCC 21454和Streptomycessp.Tü4128)中分别被克隆。测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性。将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生。将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9。     

叶片衰老时的生理生化变化

伴随叶片衰老的代谢变化已被全面地综述了(Beevers,1976;Thimann,1980;Thomas和Stoddart,1980;Woolhouse,1982,1983),这里仅仅简单地概括这些代谢变化。普遍观察到的两种主要生化变化是大量的蛋白水解和叶绿素丧失。通常,蛋白水解先于叶绿素的丧失,例如在离体燕麦叶片中,蛋白水解在离体后6小时开始,叶绿素降解晚18小时发生。蛋白水解时伴随有游离氨基酸的增加(Malik,1982;Wang等1982),在附生叶中这些氨基酸被转运出叶子(Thimann等1974;Beevers,1976)。在离体叶或者叶园片中,氨基酸的积累可能促进衰老(Malik和Thimann,1980)。伴随着蛋白水解和变黄,细胞     

一种新的与渗调蛋白基因启动子结合的蛋白基因的分离

渗调蛋白基因可受多种外界环境因子的诱导表达,并与植物细胞的渗透调节、抗逆境及植物抗病性等重要的生理过程有着密切关系,通过寻找与渗调蛋白基因启动子中FA区域DNA结合的蛋白,克隆参与该基因表达调控的反式作用因子,有利于明确渗调蛋白基因在转录水平上的调控机制,揭示外界环境因子通过信号传导系统诱导渗调蛋白基因表达的过程。利用近年来发展起的酵母单杂交系统,从适盐的烟草悬浮细胞的cDNA文库中分离到1个可与渗调蛋基因启动子中FA片段结合的蛋白因子的基因OPBP1。核酸序列分析表明OPBP1包含有一个完整的阅读框架,可编码277个氨基酸,氨基酸序列的比较分析表明该蛋白与近年来发现的一类新的DNA结合蛋白如EREBP,AP,ANT等具有相同的保守区,其中一些氨基酸完全相同,OPBP1与EREBP3最接近,同属该类新的DNA结合蛋白的第1组,仅有1个保守区。     

珊瑚菜ITS序列的PCR扩增与测序分析

为加强珍稀濒危物种珊瑚菜遗传多样性的研究和种质资源的保护工作,本实验对珊瑚菜ITS基因片段的PCR扩增条件进行了优化和产物的测序分析.结果显示:珊瑚菜ITS基因片段的PCR扩增最佳反应体系为Buffer 2. 50μL,d NTP 0. 50μL,引物ITS1和ITS4各1. 00μL,Taq DNA polymerase 0. 15μL,模板DNA 2. 00μL,dd H2O 17. 85μL,总体积25. 00μL.最佳扩增程序为94℃预变性5. 0 min,94℃变性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸1 min 45 s,37个循环,后72℃延伸10 min.在最佳扩增条件下获得了清晰、稳定的目的条带,测序后获得长度为628 bp的核苷酸序列,通过GenBank的BLAST比对验证,确定为ITS序列,其中包括完整的ITS1序列和5. 8S r DNA序列以及ITS2的部分序列.     

从12SrRNA部分基因序列探讨鳄的系统发生关系

本文用常规方法测定了雅卡凯门鳄（caiman yacane）、新几内亚鳄（crocodylus novaeguineae）等2种鳄类的约400bp的mtDNA12SrRNA基因片段的部分序列，所测序列与GenBank中的其他18种鳄类的12SrRNA基因相应片段同源序列一起经Clustal X1．8软件进行比对，并以乌龟（chinemys reevesii）为外群，用ClustalX（1．8），Mega2软件以及paup软件将这20种鳄的12SrRNA基因部分序列进行比对后构建了20种鳄的进化关系树，并分别用NJ树，MP树探讨它们之间的系统发生关系。其结果显示：食鱼鳄属Gavialis与马来假食鱼鳄属Tomistoma的亲缘关系较近，构成姐妹群并位于鳄科分支的基部。非洲窄吻鳄（Crocodylus cataphractus）与骨喉鳄（Osteolaemus retraspis）形成姐妹群，它们的亲缘关系比与其它真鳄类的关系更近，赞同非洲窄吻鳄应从鳄属中独土出来归属于长吻鳄属Mecistops的观点，因此鳄科包括鳄属、骨喉鳄属和长吻鳄属，它们的关系为（鳄属（骨喉鳄属，长吻鳄属））。鼍科4属中凯门鳄属与黑鳄属关系最近，接下来的是古鳄属、鼍属，而且鼍属是鼍科中起源最早的类群。扬予鳄（Alligator sinensis）与密河鳄（Alligator mississippiensis）较近的亲缘关系得到支持，但它们并没有形成姐妹群关系。     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

基于NCBI核酸数据库资源的黑曲霉微卫星序列的筛选

为了筛选黑曲霉微卫星序列,丰富黑曲霉的基因组资料,从而为开发黑曲霉多态性高的微卫星标记提供参考,本研究利用生物信息学方法在黑曲霉基因组中查询微卫星序列,并对其基因组中微卫星数量、丰度进行了研究.利用SSRHunter 1.3在长度为2704975 bp的黑曲霉基因组中找到了171个微卫星序列.结果表明:在黑曲霉微卫星序列所有重复类型中,以两碱基重复数目最多,为92个,占重复序列总数目的 53.80%;其次是三碱基重复,为70个,占40.94%;再次是四碱基9个,占5.26%.在两碱基重复序列中,AG重复类型最多(24.56%),GC最少(1.17%).三碱基重复序列中,共发现10种重复类别,其中以ACC重复类型最多(7.01%),最少的是AAT,ATC和GCC,占1.75%.四碱基重复中,共发现8种重复类别,除GGAT重复序列为2个(1.17%)外,其他分别各有1个(0.58%).同时选取黑曲霉中二碱基的重复次数在七次以上的微卫星序列和三碱基的重复次数在六个以上的微卫星序列,利用Primer Premier5.0软件来设计引物,为后续微卫星标记的筛选奠定基础.