黄鳝mtDNA的分离纯化及多态性的检测

采用差速离心方法以及DNasel、RNase消化法制备并纯化了黄鳝(monoplerus albus)肝脏线粒体DNA(mtDNA),进行了紫外吸收光谱的鉴定,采用8种限制性内切酶对黄鳝mtDNA进行了分析.黄鳝种内存在广泛的mtDNA多态性(Polymorphism).BglⅡ、XbaⅠ、XhoⅠ在mtDNA分子上均只有1个切点.经EcoRⅠ、PstⅠ、BamHⅠ酶切mtDNA都出现2种酶切类型,Ⅰ型各具2、4、1个片段,Ⅱ型各具1、1、3片段.BglⅠ、HindⅢ酶解后亦出现2种酶切类型,切点总数分别为11、7个.黄鳝mtDNA分子量为10.05×10~6d,大小约为16.27Kb.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

人类基因组计划的内容

能与曼哈顿原子弹计划和阿波罗登月计划相比拟的美国人类基因组计划,预期耗资30亿美元,历时15年。该计划从动议到实施经历了漫长的岁月(1984～1989)。其主要内容是:基因组作图和顺序、信息和材料的管理、实施和管理的战略。 (1) 基因组作图。有两大类人类基因组图谱:遗传连锁图谱和物理图谱。遗传连锁图谱主要通过家谱分析和测量不同性状一起遗传(即连锁)的频率而建立的。物理图谱是通过对构成人类基因组的脱氧核糖核酸分子的化学测度而绘制的。它包括限制酶切图谱、排序的脱氧核糖核酸克隆库以及对表达基因或无特征(功能不清)的脱氧核糖核酸片段的低分辨图谱。所有图谱的目标都是     

草鱼RAPD指纹的初步研究

运用 2 0个随机引物对草鱼 (Ctenopharyngodonidells)进行了随机扩增多态DNA(Ran domamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)分析 结果表明 ,所用引物都能对草鱼扩增出稳定的RAPD谱带 ,扩增的谱带数在 2～ 1 1之间 ,扩增的片段大小在 0 1kb～ 3 0kb之间 ;其中 ,OPM - 9等 6个引物能在草鱼个体间扩增出多态性片段 ,占引物总数的 33 3% ,OPM - 1等 1 4个引物对草鱼不同个体扩增的谱带是一致的 ,占引物总数的 66 7% ,为草鱼种质资源及遗传多样性的研究奠定了基础     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料,采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN;用磁珠法分离得到纯化的mRNA;在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA;经与质料载体重组和转化大肠杆菌,成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库.经检测,文库存容量达106,重组率为88.21%.测序结果表明:克隆片段长度一般都大于600 bp,说明构建的文库质量较高,能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要,为进一步研究奠定了很好的物质和技术基础.     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

建鲤与兴国红鲤RAPD指纹的初步研究

运用 2 0个 10bp随机引物对建鲤 (Cyprinuscarpiovar .jian)和兴国红鲤 (Cyprinuscarpiovar .singuonensis)进行了RAPD -PCR反应。所用引物中 ,除 2个没有扩增产物外 ,其它引物都能对建鲤和兴国红鲤扩增出清晰的RAPD谱带 ,扩增的片段大小在 0 .2kb～ 3.0kb之间。其中 ,8个引物对建鲤个体的扩增有多态现象 ,占引物总数的 40 % ;5个引物对兴国红鲤个体的扩增有多态现象 ,占引物总数的 2 5 %。为建鲤和兴国红鲤RAPD分子标记的建立和品种鉴定提供了基础资料     

硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究

本文选择硫氧还蛋白 (TRX)和硫氧还蛋白变体 (TRXL79K)分别酶切后得到的两个片段 :N片段 (1 -73 )和 C片段 (74-1 0 8)作为研究对象 .在硫氧还蛋白变体中用赖氨酸代替原来 79位的亮氨酸 ,对两组 N片段和 C片段在自然状态下重新结合的稳定性和动力学进行对比 ,得到以下结论 :1 .TRX中处于 β折叠状态的 β4区域 (P76,T77,L78,L79,L80 ,F81和 K82 ) 〔3〕中氨基酸的改变对 N片段和 C片段重新聚合成非共价键聚合物的动力学过程有一定的影响 .2 .79位氨基酸的改变对N片段和 C片段形成非共价键同原二聚体的稳定性有较大的影响 .     

螺旋藻胞内核酸酶种类初探

无菌钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株胞内核酸酶活性很强,对不同酶切底物λ-DNA和质拉8760都有不同的酶切位点。以A9藻株对质粒8760的酶切电泳图片与8760的酶切图谱进行分析比较,可初步确定A9藻株内至少具有2～3种胞内核酸酶,分别是SpaPⅡ、SpaPⅢ、spaPⅣ,它们分别是PvuⅠ、PvuⅡ、HindⅢ的同裂酶。     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

黑胸散白蚁肠道鞭毛虫共生细菌的初步研究

黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis)是在我国广泛分布的一种木食性白蚁,它的肠道内共生着大量的原生动物和原核生物。对其肠道内共生微生物的研究,有助于阐明木食性白蚁消化木质纤维素等植物源食物的机制。运用分子克隆技术对该白蚁肠道中鞭毛虫(Pyrsonympha grandis)相关共生细菌进行系统发育分析的结果。构建了与黑胸散白蚁肠道内共生鞭毛虫P.grandis相关的共生细菌的16SrDNA文库,通过对挑选克隆的RFLP分析选择了4个克隆进行测序,系统发育分析表明这4个克隆分别属于拟杆菌,"白蚁菌群1(Termite group 1)",γ-紫细菌,和β-紫细菌。     

蛋白质二级结构序列片段的识别

识别蛋白质二级结构片段,实质上是从序列片段的水平上对二级结构进行预测.用离散量的方法,通过一系列的计算发现:选择氨基酸(20种氨基酸加一个空位)和其紧邻关联共同为参数,从N端截取固定长序列片段为6或7个连续氨基酸残基时,10交叉检验平均预测精度能达到75%~77%,jack-knife检验平均预测精度能达到72%;当固定长序列片段为9或10个连续氨基酸残基时,10交叉检验平均预测精度能达到82%~83%,jack-knife检验平均预测精度能达到74%~76%.     

pGH基因全序列ApaⅠ酶切位点多态性与生产性能的相关分析

本实验利用PCR-RFLP技术分析了约克夏和长白猪pGH基因ApaⅠ酶切位点多态性及其与生产性能的关系.结果表明,在pGH基因序列中共检测到5种基因型,4种等位基因,基因型频率和等位基因频率在2个猪品种间分布差异不显著;约克夏ApaⅠ酶切多态位点中,AC基因型个体在165日龄体重和70-165日龄日增重上显著高于AA基因型个体(P＜0.1);但长白猪ApaⅠ多态位点不同基因型在这两个生产性状上的差异不显著.     

应用PCR-RFLP技术检测二甲基精氨酸二甲胺水解酶2基因-449G/C多态性的实验研究

目的确定聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测二甲基精氨酸二甲胺水解酶2(dimethyl arginine dimethylamine hydrolase 2,DDAH2)基因-449G/C的最适实验条件。方法对影响DDAH2基因PCR反应的主要因素进行研究。结果最适变性温度为95℃,最适退火温度为58℃,最适引物浓度为0.25μmol/L,最适2X Power Taq PCR Master Mix浓度为12.5μl,酶切体系为15.5μl体系中加5.0μl产物用5U的限制性内切酶Sma I消化。结论应用PCR-RFLP技术建立的DDAH2基因-449G/C位点多态位点检测方法简便、经济、快速。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位.甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础.本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession:JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测.将获得的PGIP基因命名为BoPGIP.该基因DNA全长为1065bp,包含1个内含子和2个外显子.外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26.该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65～68,106～109,130～133,254～257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189～191),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(73～76,78～81,151～154,182～185,304～307)和4个N-豆蔻酰化位点(157～162,188～193,236～241,273～278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79％helix,13.89sheet和54.32％loop,二级结构以无规则卷曲为主.通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础.     

经尿道等离子体双极电切术治疗高危前列腺增生症

目的探讨经尿道等离子体双极电切术治疗高危前列腺增生症(BPH)的围手术期处理经验,以提高手术的安全性及疗效.方法将合并严重心血管疾病、糖尿病、中风后及阻塞性肺部疾患的前列腺增生症患者定为高危患者.我院自2003年1月至2004年8月开展经尿道等离子体双极电切术治疗高危前列腺增生症41例,前列腺23～76g,平均(41.3±15.8)g;术后随访6个月.结果手术时间为40～150min,平均90rain,有2例术中或术后输血.术后膀胱持续冲洗时间3～5d,平均数3～5d.术后置管3～5d,术后住院时间5～7d,术中无被膜穿孔及闭孔神经反射发生,无水中毒、尿失禁、附睾炎及继发性出血发生,拔除尿管后均排尿通畅.术后1、3个月最大尿流率(Qmax)由术前的(5.0±4.3)ml/s分别上升至(18.9±5.1)ml/s,(21.5±6.0)ml/s;国际前列腺症状评分(IPSS)由术前的25.5下降至5.6,5.3;生活质量评分(QOL)由术前的5.6分别降至1.6,1.3.3项指标手术前后比较差异均有显著性意义(P<0.05).结论经尿道等离子体双极电切术治疗高危前列腺增生症是安全有效的.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genesean软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

肽-HLA-A2融合蛋白用于四聚体(Tetramer)的改造

目的对蛋白四聚体(Tetramer)进行改造,简化其制备过程,提高制备效率,节约成本.方法利用基因工程技术,将肽-HLA-A2和BirA酶的底物肽(BSP)形成一个融合蛋白,该融合蛋白在原核中以包涵体的形式被表达,对表达的包涵体蛋白进行稀释复性、酶切和纯化后,再在BirA酶的作用下对其生物素化,最后将其连接到荧光素标记的亲和素上,即形成了改造的Tetramer.结果获得了可溶性的蛋白四聚体.结论该方法制备过程简单,蛋白复兴效率高,成本低,值得继续深入研究.