烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

肽-HLA-A2融合蛋白用于四聚体(Tetramer)的改造

目的对蛋白四聚体(Tetramer)进行改造,简化其制备过程,提高制备效率,节约成本.方法利用基因工程技术,将肽-HLA-A2和BirA酶的底物肽(BSP)形成一个融合蛋白,该融合蛋白在原核中以包涵体的形式被表达,对表达的包涵体蛋白进行稀释复性、酶切和纯化后,再在BirA酶的作用下对其生物素化,最后将其连接到荧光素标记的亲和素上,即形成了改造的Tetramer.结果获得了可溶性的蛋白四聚体.结论该方法制备过程简单,蛋白复兴效率高,成本低,值得继续深入研究.     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

人α-干扰素基因在小菜蛾(Px)细胞中的表达

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus ,AcN PV)是杆状病毒基因工程的理想材料 本文采用一种新型的细胞系———Px细胞系为受体细胞 ,pAc373-IFN -α为转移载体 ,利用AcNPV这种表达载体成功地在Px细胞中表达了人α -干扰素基因     

降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

凋亡通路蛋白表达对过氧化氢诱导PC12细胞凋亡的影响

目的探讨过氧化氢（H2O2）诱导PC12细胞凋亡的机制。方法 MTT测定细胞存活率,荧光染色观察细胞形态,透射电镜观察细胞的超微结构,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Western blotting技术和流式细胞仪检测Bcl-2和Bax蛋白的表达,分光光度计测定Caspase-3释放率。结果 0.25 mM的H2O2可诱导PC12细胞凋亡,细胞的形态发生改变,细胞核受损,细胞内Bcl-2蛋白的表达降低、Bax蛋白的表达增加,Caspase-3被激活。结论 H2O2诱导了PC12细胞凋亡,其作用机制与细胞内Bcl-2、Bax蛋白的表达及Caspase-3活性密切相关。     

多胺氧化酶在多胺代谢中的作用

本文概括了精胺氧化酶和乙酰多胺氧化酶参与的主要的生化,细胞和生理过程,多胺氧化酶是黄素腺嘌呤二核苷酸包含酶,可以催化多胺和乙酰多胺的氧化,其底物的特异性和氧化产物的种类依赖于酶的来源.酵母菌的多胺氧化酶可以氧化精胺,N1-乙酰精胺,N1-乙酰亚精胺,然而在脊椎动物中,是由两个不同的多胺氧化酶亚家族分别承担了这些功能,即精胺氧化酶和乙酰多胺氧化酶,分别特异性地催化精胺和N1-乙酰精胺/N1-乙酰亚精胺的氧化.精胺氧化酶和乙酰多胺氧化酶高效参与多胺生物合成和降解的调节.因为多胺是细胞生长和分化的基础调节者,因此它们的体内平衡对细胞生命十分重要,而精胺氧化酶和乙酰多胺氧化酶则起到了调节体内多胺平衡的作用.精胺氧化酶和乙酰多胺氧化酶参与药物反应,细胞凋亡和应激反应,它们的异常可以改变多胺的体内平衡.多胺分解代谢的调节异常经常与包括癌症在内的几种病理状况有关.     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

东亚飞蝗pSMC重组抗原表达及多克隆抗体制备

采用生物信息学方法对pSMC抗原特性进行分析;利用DNA重组技术构建pSMC_(249-383)重组表达菌株;以Ni亲和层析技术纯化重组pSMC_(249-383)蛋白;用重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠,制备Anti-pSMC多克隆抗体;采用免疫荧光法检测pSMC在血细胞中的定位。将p SMC编码区249-383区段插入pET30a(+),成功构建了pSMC_(249-383)原核表达菌株;用表达、纯化获得的重组pSMC_(249-383)蛋白免疫小鼠成功获得了高效价的Anti-pSMC多克隆抗体;免疫荧光检测显示pSMC在东亚飞蝗血淋巴吞噬细胞高表达,定位于细胞核,为研究pSMC功能奠定了基础。     

D-柠檬烯对人胃癌MGC803细胞增殖和凋亡的影响

目的研究D-柠檬烯对人胃癌MGC803细胞生长抑制和凋亡的影响。方法噻唑蓝(MTT)法比色检测细胞生长情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;激光共聚焦检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量和caspase- 3蛋白的表达。结果D-柠檬烯对人胃癌MGC803细胞生长抑制作用呈剂量依赖关系;流式细胞仪检测发现D-柠檬烯可引起MGC803细胞凋亡,且呈时间依赖性;激光共聚焦显微镜荧光检测发现D-柠檬烯处理的细胞内ROS明显升高(P<0.05),caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论D-柠檬烯能够有效地抑制癌细胞的生长以及诱导凋亡。这种作用机制可能是使MGC803细胞内产生大量的活性氧。也可能与细胞内caspase-3基因的表达变化有关。     

人类新基因CHID1的克隆与功能初步研究

使用生物信息学手段,从人公共蛋白质数据库的蛋白质序列中筛选到新的分泌蛋白基因CHID1(Chitinase domain containing 1),该基因定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5),cDNA长1 182 bp,其编码蛋白共有393个氨基酸。转染COS-7细胞后Western blot实验显示:在细胞培养液中没有检测到CHID1蛋白。对CHID1基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现:它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,肝中最高。细胞生长曲线揭示,Lovo-CHID1稳定细胞株有生长抑制的现象,而细胞周期分析发现细胞株在G1期发生阻滞。这表明CHID1有可能是个潜在的抑癌基因。     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

一种新的与渗调蛋白基因启动子结合的蛋白基因的分离

渗调蛋白基因可受多种外界环境因子的诱导表达,并与植物细胞的渗透调节、抗逆境及植物抗病性等重要的生理过程有着密切关系,通过寻找与渗调蛋白基因启动子中FA区域DNA结合的蛋白,克隆参与该基因表达调控的反式作用因子,有利于明确渗调蛋白基因在转录水平上的调控机制,揭示外界环境因子通过信号传导系统诱导渗调蛋白基因表达的过程。利用近年来发展起的酵母单杂交系统,从适盐的烟草悬浮细胞的cDNA文库中分离到1个可与渗调蛋基因启动子中FA片段结合的蛋白因子的基因OPBP1。核酸序列分析表明OPBP1包含有一个完整的阅读框架,可编码277个氨基酸,氨基酸序列的比较分析表明该蛋白与近年来发现的一类新的DNA结合蛋白如EREBP,AP,ANT等具有相同的保守区,其中一些氨基酸完全相同,OPBP1与EREBP3最接近,同属该类新的DNA结合蛋白的第1组,仅有1个保守区。     

透明颤菌血红蛋白基因在产TRAIL蛋白大肠杆菌中的克隆表达

为解决大肠杆菌高密度发酵生产TRA IL过程中的供氧矛盾,提高菌体的发酵密度,在大肠杆菌中引入透明颤菌血红蛋白基因(vgb)。聚合酶链反应(PCR)检验和CO差光谱法检验表明:vgb基因能够在C 600(pBV 220-TRA IL)中表达并受溶氧调控,重组菌CTV具有良好的遗传稳定性。3.7 L发酵罐实验表明:在同样的发酵条件下,含vgb基因的重组菌CTV的最高菌体密度为对照菌的1.64倍,达到50.6 g/L,乙酸积累为对照菌的55.6%,TRA IL蛋白产量提高了70%,达到2.8 g/L。     

SSAO酶活性的测定方法研究

SSAO(semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase 1、4、3、6)是时氨基脲敏感的一系列酶的统称,它在人体内广泛分布但生理功能尚不清楚。一些研究显示该酶可能与糖尿病并发症、心脏病以及一些神经系统疾病等有着一定的联系。SSAO的内源性底物包括甲胺和氨基丙酮等,它们通过酶催化氧化脱氨产生相应的醛、过氧化氢和氨。甲醛、丙酮醛和过氧化氢都是细胞毒性的物质。本研究我们用ABTs作为衍生过氧化氢的试剂,建立了一种操作简便、安全并且具有相当灵敏度的一种测定方法。实验结果显示该方法具有足够的灵敏度,能够满足SSAO酶活性测定的需要。该方法的建立为糖尿病和心脑血管疾病等疾病的病因学研究以及临床样品分析提供了一种适用的方法。     

吸烟与疾病关系的哲学思考

根据哲学系统论的观点．人体是一个开放的系统，与周围环境发生相互作用。香烟及其烟雾中含有3800多种化合物，其中有毒物质达几百种，至少有43种是致癌物质。但是个体对吸烟的依赖性及吸烟与疾病关系有个体差异细胞。色素（cytochrome，p450）CYP2A6是一种高度多态性基因（已发现10余种等位基因），这种酶主要由肝脏表达．对很多药物和环境中化合物的清除起重要作用。CYP2A6可激活许多结构上非相关的前致癌物．是主要的尼古丁C-氧化酶，CYP2A6与尼古丁的代谢和激活亚硝胺成为最终致癌物密切相关。