植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

真菌诱导型植物表达载体pBP的构建

根据prp1-1启动子序列设计并合成了一对引物,通过PCR扩增的方法从马铃薯基因组中扩增到了病原诱导的prp1-1启动子,并将其克隆到PGEMT-Easy载体上,然后进一步克隆到植物表达载体pBI101.2上,构建了病原诱导型基因表达载体pBP.     

农杆菌介导的菊花转基因研究

为了在地被菊中建立外源基因的转化体系和获得转基因地被菊美矮黄植株,利用农杆菌介导法在地被菊美矮黄中建立了转化体系,并获得了转入外源基因CHS的转基因植株,PCR-Southern 杂交和Southern杂交都已经证实了外源基因的转入.研究中发现潮霉素对转化植株分化具有一定的抑制作用.     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的结构

本文从基本结构和特异结构两方面对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因结构的最新研究成果进行了综述。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

植物遗传工程的载体

高等植物的遗传工程,旨在用分子生物学和细胞生物学的方法,把外源遗传物质——目的基因或含有目的基因的DNA片段,通过载体或其它技术导入受体细胞并使之发生遗传转化,再利用植物细胞的全能性来获得转化了的植株。本文主要介绍近年来,寻求植物遗传工程载体系统的研究概况。     

ARF基因导入烟草的遗传转化研究

以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS+0.8 mg.L-16-BA+0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS+0.02 mg.L-1IBA+0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中.     

Arthrobacter globiform is酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.