应用差速离心法提纯禽脑脊髓炎病毒及电镜观察

为了建立一种有效的方法分离禽恼脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus．AEV），本实验通过SPF鸡胚首先来增殖AEV．将1：5倍稀释的AEV-NH937株和阴性对照磷酸缓冲赫溶液分别经卵黄囊接种于6日龄SPF鸡胚，继续孵化10d后，收集尿囊液，比较接种组和健康对照组鸡胚的大小．结果显示．健康对照组鸡胚明显大于接种组．取接种组的胚脑、消化道和胰腺，经匀浆后与同组尿囊液配成1：5的组织悬液，应用差速离心法从该组织悬液中分离纯化AEV，经纯化的AEV被磷钨酸染色后．电镜下可观察到大量AEV粒子，结果表明．差速离心法提纯禽脑脊髓炎病毒效果良好。     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位.甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础.本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession:JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测.将获得的PGIP基因命名为BoPGIP.该基因DNA全长为1065bp,包含1个内含子和2个外显子.外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26.该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65～68,106～109,130～133,254～257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189～191),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(73～76,78～81,151～154,182～185,304～307)和4个N-豆蔻酰化位点(157～162,188～193,236～241,273～278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79％helix,13.89sheet和54.32％loop,二级结构以无规则卷曲为主.通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础.     

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS24(Ribosomal Protein S24)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫RPS 24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15.3251kD,pI为10.92,含有7种类型共14个功能位点:即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e sig-nature.进一步分析发现,大熊猫RPS 24基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为94.1%、92.4%、94.7%、89.9%和90.4%;与人RPS 24蛋白的氨基酸序列同源性为98.48%,其余均为99.24%.     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

肽-HLA-A2融合蛋白用于四聚体(Tetramer)的改造

目的对蛋白四聚体(Tetramer)进行改造,简化其制备过程,提高制备效率,节约成本.方法利用基因工程技术,将肽-HLA-A2和BirA酶的底物肽(BSP)形成一个融合蛋白,该融合蛋白在原核中以包涵体的形式被表达,对表达的包涵体蛋白进行稀释复性、酶切和纯化后,再在BirA酶的作用下对其生物素化,最后将其连接到荧光素标记的亲和素上,即形成了改造的Tetramer.结果获得了可溶性的蛋白四聚体.结论该方法制备过程简单,蛋白复兴效率高,成本低,值得继续深入研究.     

植物抗病毒病基因工程研究与展望

用植物基因工程技术来获得抗病毒植物时研究主要通过以下五个途径:利用病毒外壳蛋白基因抑制病毒脱壳;利用mic免疫系统限制相应病毒复制;利用卫星RNA限制相关病毒的复制;利用ribozyme裂解病毒基因组;利用植物自身编码的抗病基因产物PR蛋白。本文对上述途径的近年研究作了综述和分析,并提出展望。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

现代汉语“有＋VP”结构特征简析

从语言事实入手，把“有＋VP”分为两类：一类能受程度副词修饰（“有＋VP1”），一类不能受其修饰（“有＋VP2”）。主体部分对这两类结构在句法、语义、语用三个平面进行了深入分析，力求解释造成两类结构与程度副词结合状况差异的原因。     

“NP1像VP＼AP一样（VP＼AP）”句式的辞格规约性考察

“NP1像……一样”句式，是比喻句的常用格式，根据其成句的结构类型，大体可分为三类：NP1像NP2一样（VPIAP）、NP1（VP）像NP2一样（AP）、NP1像VP＼AP一样（VP＼AP），前两类是典型的比喻句，而第三类情况复杂。根据比喻辞格成活必备三元素的特征，对NP1像VP＼AP一样（VP＼AP）的本体、喻体进行探寻并在此基础上，从表层形式、中层语义、深层理论三个角度考察了该句式比喻辞格的规约性，为判定比喻辞格提出了一个开放性的理论。     

高效液相色谱法分析盐藻粉中维生素E的研究

本文利用高效液相色谱法对盐藻粉中维生素E含量进行测定,确立了一套完整的测定盐藻粉中维生素E的分析方法.实验采用高效液相色谱C 18柱,以甲醇为流动相,流速1 mL/min,将维生素E分离,经紫外检测器检测.维生素E标准曲线的回归方程R=0.99994,本测定方法的变异系数为1.15%,回收率93.0%~107.0%.通过对皂化时间、KOH用量、焦性没食子酸用量以及蒸发温度等因素的分析,确定了样品制备最佳实验条件.正交实验表明焦性没食子酸用量和KOH用量是影响样品制备的显著性因素.     

近三十年来形容词作状语研究述评

近三十年来汉语状形述结构研究集中于四个问题:形容词状语的本质、状形述结构研究视角、研究方法和研究主题。判定状形述结构形容词状语的本质应兼顾句法和语义层面，充分考虑句法、语义、形式与意义、语用、认知等因素；状形述结构研究应采用多元化视角综合考察；状形述结构研究宜采用定量分析与定性研究相结合的研究方法；形容词作状语的研究有待进一步归类、分析和解释，语义指向研究有待加深，目前仍然缺少服务第二语言教学的实证研究。     

辽东湾地区下第三系有效烃源岩分布定量研究

有效烃源岩是指地质过程中形成的,既有油气生成又有油气排出的烃源岩。传统研究方法只停留在定性划分有机质丰度下限、实测数据分析和模拟实验结果的基础上,并没有完全形成一套定量的评价方法体系。在排烃门限理论的基础上,利用生烃潜力法确定出研究区的排烃门限,建立各层段有效烃源岩的判别图版,形成了一套有效烃源岩定量研究方法体系,并将其应用到辽东湾地区。研究表明,辽东湾地区下第三系发育东三段、沙一、沙二和沙三段三套有效烃源岩,其中沙三段的规模最大。尽管东二段暗色泥岩也普遍发育,但并没有达到排烃的临界条件,只能作为一般烃源岩,不能认定为有效烃源岩。     

稀土元素Ce对Al－Mg－Si合金断裂韧性的改善及其细观机理分析

用三点弯曲（ＴＰＢ）裂纹试件测定平面应变条件下的断裂韧性Ｊ１ｃ与ＪＲ，试验结果表明，稀土Ｃｅ较大地提高了Ａｌ－Ｍｇ－Ｓｉ合金的起裂韧度值Ｊ１ｃ，特别是，显著地改善了合金的裂纹扩展抗力ＪＲ。金相显微观察和电镜分析表明，稀土Ｃｅ改善了材料的初始细观结构（材料在加载前的组织结构），改变了材料的细观损伤特点，发展了材料的含损伤塑性。     

疲劳硫化天然橡胶交联密度测试研究

本文通过对硫化天然橡胶疲劳试件交联密度测试研究发现,无论是单轴还是多轴循环载荷作用下。其交联密度都随着轴向应变幅值的增加而增大,同时在相同的轴向应变的作用下,多轴载荷作用下破坏试件的交联密度比单轴的大．     

“有＋VP”2结构分析

“有＋VP”1和“有＋VP”2二者存在区别：“有1”是动词，VP1只能是少部分单双音节动词，担任“有1”的宾语，“有2”承担三种语法功能，VP2不受音节或性质的限制，结构类型丰富。“有＋VP”2结构在殷商时代就已出现，“有”的隐退与“了”的出现有着很重要的关系，“了”的专职身份使得“有＋VP”2格式在主流语言中隐退。“有＋VP”2复出受方言、外来语、传媒、语言机制、自身优势等因素的影响。