以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n(pGL-MDR1)∶n(pRL-TK)=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

建立一个基于报告基因的靶标筛药系统筛选上调ABCA1基因转录的中药提取物

ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)具有催化外周细胞过量胆固醇和磷脂外向流出的功能。本实验将ABCA1启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,并将得到的重组质粒pGL3B-neo/ABCA1转染入人肝癌细胞(hepG2)。通过稀释培养法最终得到含有重组质粒的稳定细胞系SABCA1。利用这个报告基因为基础的药物筛选系统,筛选了100多种中药提取物。通过荧光素酶活性测试,相对活性达到180%以上的有4种中药提取物,并最终挑选能明显激活ABCA1基因启动子的鬼箭羽水提组分进一步研究,得出半数有效浓度(EC50)为48.06 mg/L。此外,利用基于apoA1基因的药物筛选系统验证得出鬼箭羽水提组分也能促进apoA1基因的表达。     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

应用人工启动子培育广谱抗病性作物的进展与设想

转基因抗性作物常因目的基因的过表达而造成品质下降、减产、甚至畸形发育.因此,转基因抗病必须解决好广谱抗性、持久抗性和消除副作用等关键问题.本文综述了病原物诱导型启动子的克隆,总结了基因工程中应用病原物诱导型启动子的优点,分析了病原物诱导型启动子中与诱导抗病相关的保守系列,提出了构建人工启动子和选用npr1基因培育广谱抗病性作物的设想.     

基于报告基因能筛选下调p66~(shc)基因转录的药物普筛系统的建立

将p66shc基因的启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,然后将重组质粒pGL3B-neo-p66shc转染入人的肺癌细胞A549中,通过单集落分离法得到含有重组质粒的稳定细胞系A549/p66shc。利用这个以报告基因为基础的药物普筛系统,筛选了数百种中药提取物及单体化合物,发现抑制率达到50%以上的2种中药提取物和8种单体化合物。     

一种新的与渗调蛋白基因启动子结合的蛋白基因的分离

渗调蛋白基因可受多种外界环境因子的诱导表达,并与植物细胞的渗透调节、抗逆境及植物抗病性等重要的生理过程有着密切关系,通过寻找与渗调蛋白基因启动子中FA区域DNA结合的蛋白,克隆参与该基因表达调控的反式作用因子,有利于明确渗调蛋白基因在转录水平上的调控机制,揭示外界环境因子通过信号传导系统诱导渗调蛋白基因表达的过程。利用近年来发展起的酵母单杂交系统,从适盐的烟草悬浮细胞的cDNA文库中分离到1个可与渗调蛋基因启动子中FA片段结合的蛋白因子的基因OPBP1。核酸序列分析表明OPBP1包含有一个完整的阅读框架,可编码277个氨基酸,氨基酸序列的比较分析表明该蛋白与近年来发现的一类新的DNA结合蛋白如EREBP,AP,ANT等具有相同的保守区,其中一些氨基酸完全相同,OPBP1与EREBP3最接近,同属该类新的DNA结合蛋白的第1组,仅有1个保守区。     

绿色荧光蛋白基因在转基因金鱼中的整合与表达

通过分子克隆技术将鲤鱼β—肌动蛋白启动子(carpβ-actinpromoterA)与编码绿色荧光蛋白(GFP)的cD NA融合构建成能在真核生物体内表达的质粒载体pAGFP。质粒pAGFP经PvuⅠ线性化后采用显微注射法导入金鱼受精卵,在胚胎发育初期,经紫外光激发能观察到少数胚胎发绿色荧光。在通过PCR实验检测出的5个阳性个体染色体DNA中,经点杂交实验证实有2个个体染色体基因组上整合了GFP基因。     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

思想政治教育载体研究综述

20世纪90年代"载体"这-概念进入思想政治教育领域,形成了"思想政治教育栽体"这一概念,并日益受到学术界的关注.到目前为止,学术界对思想政治教育载体的内涵、特征、分类、功能等进行了广泛的探讨.但从总体上看对思想政治教育载体的探讨还远不够深入,需要进一步加强思想政治教育载体的理论研究.     

葡萄糖耐受者空腹甘油三酯与重IGF-1启动子区的多态性研究

目的为了检测IGF-1基因启动子区的微卫星多态性中的等位基因与Ⅱ型糖尿病的相关性,并在葡萄糖耐受性人群中进行相关性状的定量分析。方法 IGF-1基因启动子多态性的研究通过对347名Ⅱ型糖尿病患者和109名葡萄糖耐受性者作为对照进行的研究。结果本研究没有发现启动子区缺少等位基因的与Ⅱ型糖尿病或是葡萄糖耐受性者中的葡萄糖耐受机制间存在相互关系(P =0．25)。在Ⅱ型葡萄糖耐受性糖尿病患者的空腹血清甘油三酯水平与野生型等位基因间存在相互关系(P=0．002)。结论本研究表明,IGF-1基因启动子多态性的野生型等位基因与葡萄糖耐受性人群空腹血清甘油三酯水平增加之间存在相互关系。     

SIRT1 mRNA在C2C12成肌细胞增殖过程中的时相性变化

以小鼠骨骼肌成肌细胞（C2C12）为研究对象,用MTT法检测细胞1～5 d内的增殖活性,用荧光定量聚合酶链式反应法检测SIRT1 mRNA表达水平,探讨第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶1（SIRT1）mRNA在C2C12成肌细胞增殖过程中的时相性表达.结果表明,接种后前2天细胞处于潜伏期,3～4 d进入对数增殖期,5 d后逐渐进入平台期;与第1天相比,第2天的SIRT1 mRNA表达没有显著性差异,第3～5天显著性分别增加了1.8、2.3和2.4倍,且SIRT1mRNA表达与细胞增殖活性呈中度正相关,提示SIRT1 mRNA表达与成肌细胞增殖速度密切相关.     

方向和位置对S160功能影响的研究

研究抑制序列S160对基因表达的影响。首先将hKv4.3基因5非翻译区的一段序列（＋2～＋160,S160）以不同的方向和位置克隆到报告质粒pβ-gal-promoter vector中,瞬时表达,之后进行β-galactosidase相对活性分析。结果表明S160对基因表达具有强烈的抑制作用,且抑制序列S160的抑制功能具有位置特异性,没有方向特异性。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

盐酸多奈哌齐对拟VD大鼠模型海马神经元保护作用机制的研究

目的观察盐酸多奈哌齐对血管性痴呆(VD)大鼠模型海马NMDA受体亚单位NPR1的免疫组织化学表达的变化,及对GSH-PX、CAT的影响,探讨其在血管性痴呆中的神经保护作用机制。方法采用双侧颈总动脉反复夹闭、再通, 并腹腔注射硝普钠法制备模型,药物组用盐酸多奈哌齐溶液灌胃;用Y-型迷宫试验观察其行为学改变;用免疫组织化学技术观测大鼠海马神经元N-甲基-D -天门冬氨酸受体-R1的表达变化;GSH-PX、CAT分别采用DTNB法及紫外分光光度法测定其活力。结果盐酸多奈哌齐组大鼠学习、记忆成绩优于模型组 (P<0．01),其海马CA1区NMDA受体-R1表达明显降低,与模型组比较有显著性差异(P<0．01);GSH-PX、CAT较模型组明显增高(P<0．01),与假手术组相比无显著性差异(P>0．05)。结论盐酸多奈哌齐可通过降低NMDAR1的表达,提高GSH-以、CAT的活力来保护VD大鼠海马神经元。     

糖尿病大鼠胰腺组织SUR1蛋白表达及药物干预

目的观察糖尿病大鼠胰腺KATP通道的SUR1亚基蛋白表达变化,以及那格列奈、丹参素对其干预的结果。方法wistar大鼠高糖高脂饲料加静脉注射链脲佐菌素法建立糖尿病模型后,西药组给予那格列奈（37.5mg/kg体重）,中药组给予丹参素（0.224mg/kg体重）灌胃,4周后摘取胰腺组织,Western blot法检测SUR1蛋白表达改变。结果模型组SUR1蛋白表达显著低于对照组（P〈0.05）,那格列奈对SUR1蛋白表达表现了一定的上调作用,丹参素对其表达几乎没有影响。结论胰腺SUR1蛋白表达的降低可能是糖尿病发病的分子机制之一,对其表达的上调是那格列奈的作用机制。     

"电戏"的最初输入与中国早期影坛--为中国电影百年纪念而作

19世纪90年代,"电戏"传入中国.1897年9月5日李伯元所办的<游戏报>发表了我国第一篇"电影评论"文章.1905年秋,由北京丰泰照相馆拍摄了中国第一部电影<定军山>的片断,至今已整整100年.中国早期电影工作者主要与通俗作家合作编剧,拍摄一些中国广大市民喜闻乐见的"默片",但同时也在一定程度上注意电影的教化作用.1931年由中国电影工作者、进步的新剧艺工作者与通俗作家通力合作,拍摄了中国第一部有声片<歌女红牡丹>.在"9·18"、"1·28"后,中国民众的抗日情绪空前高涨,促使我国的电影事业在国难声中很快步入了一个左翼电影主潮期.     

n维Euclid空间中的平行体及其体积

将几何空间中的立体及其体积概念推广到n维Euclid空间中,利用向量对子空间的正交投影分解给出了平行体的计算公式和一系列性质,并将其应用于行列式的计算,得到相应的性质。     

电针治疗对大鼠脑缺血再灌注中AnnexinAl和TRPM7表达的影响

目的：电针治疗在脑缺血再灌注损伤中AnnexinA1与TRPM7共存为探讨TRPM7在脑缺血再灌注损伤中的途径提供理论依据。方法将SD大鼠随机分成正常对照组、缺血再灌组、电针治疗组、假手术组,以线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注模型,电针穴位选择“水沟”、“承浆”穴。用Morris水迷宫试验验证学习记忆能力和免疫荧光双标方法检测AnnexinA1和TRPM7在大鼠脑组织中的共存表达。结果①大鼠大脑中动脉栓塞60分钟再灌注24小时后,可出现明显学习记忆能力障碍,缺血再灌组与电针治疗组有显著性差异（P＜0.05）,在脑缺血前后以电针治疗后可显著改善大鼠学习记忆能力。②在海马CA1、CA3、皮质区,脑缺血再灌组与正常对照组相比, AnnexinA1和TRPM7共存表达升高率分别是48.06％,50.19％,30.07％（ P＜0.05）。电针治疗组与脑缺血再灌组相比,AnnexinA1和TRPM7共存表达水平下降率分别是34.88％,47.80％,41.96％（ P＜0.05）。结论脑缺血再灌注后大鼠学习记忆能力下降,且AnnexinA1和TRPM7共存表达上调,电针治疗后能够显著改善大鼠的学习记忆能力,并通过逆转AnnexinA1和TRPM7表达,且可能通过TRPM7途径来调整AnnexinA1的作用。电针有可能通过抑制TRPM7和AnnexinA1来改变神经元的凋亡命运。