骨肽对成骨细胞骨形成蛋白2表达影响的实验研究

目的 研究骨肽对成骨细胞骨形成蛋白2（BMP2）表达影响.方法 体外分离培养成骨细胞,0.02mg/ml,0.08mg/ml,0.32mg/ml三个剂量浓度骨肽分别作用24小时,应用流式细胞术检测成骨细胞增殖情况.以上三个剂量浓度骨肽再分别作用成骨细胞24小时、48小时、72小时,收集细胞上清利用酶联免疫法（ELISA法）检测BMP2表达含量.结果 三个尽剂量浓度作用24小时均可引起成骨细胞增殖,并存在剂量依赖性.骨肽各浓度组在24小时、48小时均可引起BMP2表达增高,其中0.08mg/ml剂量组作用48小时效果最为显著.结论 骨肽可促进成骨细胞BMP2蛋白表达,从而发挥促进成骨细胞增殖和分化的作用.     

Arthrobacter globiform is酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

高效液相色谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天花粉蛋白胰酶肽图谱

目的:建立了检测天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)肽图谱方法。方法:采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法对天花粉蛋白的肽图谱进行了测定,比较了不同批次产品一级结构的一致性,并用MALDI-TOF-MS法进行了验证。结果:用RP-HPLC和MALDI-TOF-MS法检测天花粉蛋白胰酶裂解后的肽段,发现各批产品的一级结构具有一致性,此分析方法具有简单,灵敏度高,可靠等优点。结论:本法适应于天花粉蛋白药物的肽谱分析,同时也为分析PEG修饰天花粉蛋白药物肽图谱提供了可以借鉴定手段。     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

基因工程药物质控方法(ELISA和HPLC)研究及应用

目的:1.建立适用于重组人生长激素(rh-GH)生产质量控制的大肠杆菌蛋白残留(ECP)测定方法。2.完成对重组人激素H1(rh-H1)的重要质量控制项目:含量、纯度、肽图的检定。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)对rh-GH产品中的ECP残留进行检测,并按照中国药典、生物制品规程及ICH有关要求进行方法学验证。采用反相高效液相色谱法对rh-H1进行了含量测定、纯度检查和肽图分析。结果:1.根据研究所得真实可靠的方法学评价结果,建立并规范了可用于rh-GH常规生产工艺控制的宿主蛋白残留检测方法。2.对三批rh-H1原液检定结果分别为,含量:100.5%、101.1%、99.8%;纯度:98.0%、98.4%、97.8%;肽图:三批原液肽图均与对照品一致。表明该产品的此三项指标均符合规定。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.