降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

骨形成因子7的分子功能研究进展及在老年医学中的应用

骨形成因子属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族中的一个亚群,BMP7是骨形成因子家族的一个成员,天然hBMP-7存在同源和异源二聚体形式,二聚体形式的hBMP-7是其生物学活性主要形式。糖尿病肾病和前列腺癌是两种常见的老年疾病,近年来发现BMP7是一个重要的功能性生物活性分子和疾病标志物,在糖尿病肾病、前列腺和乳腺肿瘤等领域均扮演重要的角色并发生表达变化。本文结合国内外最新研究进展,综述了BMP7的功能、信号调控和体外表达及其在糖尿病肾病等老年疾病中的应用。     

一株PEDV广东流行株S1基因遗传进化分析及其在昆虫细胞中的表达纯化

为了解猪流行性腹泻病毒广东流行株的S1基因流行变异情况,制备相应的诊断试剂,试验采用RT-PCR从猪流行性腹泻疑似发病仔猪的肠道内容物中扩增获得S1基因,利用生物信息学软件构建S1基因的遗传进化树.将S1基因克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1,转化至DH10Bac感受态细胞中,经抗生素筛选重组杆粒,把重组杆粒转染到昆虫细胞Sf9,盲传3代后进行间接免疫荧光试验和Western blot鉴定.结果表明：该猪流行性腹泻病毒广东流行株分布于GII-b分支,与国内猪流行性腹泻病毒分离株（HN-HB1-2018、HBHA2015）的核苷酸相似性为98.0%～98.3%,而与猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777、DR13的核苷酸相似性仅为89.9%～90.0%.且S1重组蛋白可在昆虫细胞Sf9中以细胞培养分泌上清的形式表达.本研究可为猪流行性腹泻病毒的流行现状研究提供参考,以及后续猪流行性腹泻病毒诊断制品的研发提供前期基础.     

TWIST基因和蛋白与宫颈癌发生发展关系的研究

目的:检测TWIST基因在宫颈癌组织和宫颈正常组织中的表达,探讨其与宫颈癌发生?发展的相关性及在宫颈癌诊疗中的意义?方法:收集56例宫颈癌组织和35例宫颈正常组织,用实时定量PCR检测TWIST mRNA的表达;用Western blot检测TWIST蛋白的表达,并分析TWIST mRNA在宫颈癌中的表达水平与临床病理因素及高危型HPV病毒载量相关性?结果:实时定量PCR结果显示宫颈癌组织中TWIST mRNA表达高于宫颈正常组织,差异具有统计学意义(P < 0.01);Western blot在蛋白质水平上证实了这一点(P < 0.01)?宫颈癌组织中TWIST的表达与淋巴结转移相关(P = 0.022),但与年龄?FIGO分期?肿瘤大小?病理类型?肿瘤分化程度无关(P均> 0.05),Logistic回归分析显示,高水平的TWIST mRNA表达是淋巴结转移的独立危险因子(P < 0.05)?而TWIST基因的相对表达水平与高危型HPV病毒载量无相关性(r = 0.205,P > 0.05)?结论:宫颈癌组织中TWIST的表达上调,且与是否有淋巴结转移相关,TWIST的表达可能对宫颈癌的发生?发展及转移有重要作用?     

基底拉伸应变对小鼠成骨细胞Runx2表达的影响

目的 研究基底拉伸应变对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞Runx2表达的影响.方法 实验随机分为0 με、1000 με、1500 με、2000 με、2500 με、5000 με六组,采用卫生装备研究所自行研制的细胞基底应变加载装置对细胞进行加载,Western blot检测不同应变对成骨细胞Runx2蛋白表达的影响.此外采用Real-time PCR检测0 με、2500 με、5000 με三种强度应变对成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响.结果 Western blot结果显示:1500 με、2000 με、2500 με组与0 με组相比Runx2蛋白表达显著增强(P＜0.01);5000με组与0 με组相比Runx2蛋白表达显著降低(P＜0.01);Real-time PCR结果显示:2500 με组与0 με组相比Runx2 mRNA表达显著降低(P＜0.01);5000 με组与0 με组相比Runx2 mRNA表达显著增加(P＜0.01).结论 ①生理强度的拉伸应变可显著增加MC3T3-E1细胞Runx2蛋白的表达,并且呈剂量依赖性,超生理强度5000 με显著降低Runx2蛋白表达.②同样强度的拉伸应变刺激下,Runx2基因表达与蛋白表达并不一致.     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

基底拉伸应变对小鼠成骨细胞Runx2表达的影响

摘要：目的 研究基底拉伸应变对小鼠成骨细胞系MC3T3一E1细胞Runx2表达的影响。方法 实验随机分为0με、1000με、1500με、2000με、2500με、5000με六组,采用卫生装备研究所自行研制的细胞基底应变加载装置对细胞进行加载,Western blot检测不同应变对成骨细胞Runx2蛋白表达的影响。此外采用Real?time PCR检测0με、2500με、5000με三种强度应变对成骨细胞Runx2 mRNA表达的影响。结果 Western blot结果显示：1500με、2000με、2500με组与0με组相比Runx2蛋白表达显著增强(P<0．01);5000με组与0με组相比Runx2蛋白表达显著降低(P<0．01);Real—timePCR结果显示：2500με组与0με组相比Runx2 mRNA表达显著降低(P<0．01);5000με组与0με组相比Runx2 mRNA表达显著增加(P<0．01)。结论 ①生理强度的拉伸应变可显著增加MC3T3一El细胞Runx2蛋白的表达,并且呈剂量依赖性,超生理强度5000με显著降低Runx2蛋白表达。②同样强度的拉伸应变刺激下,Runx2基因表达与蛋白表达并不一致。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体,从而为建立CDV的诊断方法提供有效试剂。将纯化后的CDV核蛋白作为免疫原注射至BALB/c小鼠腹腔中,取经4次长程免疫和1次加强免疫并达到融合标准的小鼠脾脏刮制成悬液,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞,利用间接ELISA筛选,并对单抗进行生物特性鉴定。结果表明：经过筛选后共获得2株可持续分泌抗CDV NP的单克隆细胞株,以3-3G、1-10B命名。2株细胞株抗体经效价测定均可达到1∶2 048 000;经亚型鉴定,2株杂交瘤细胞均为IgG2型;经过protein A柱纯化,抗体纯度达到了90%以上;BCA法测得抗体浓度至少达2.78 mg/mL;通过Western blot鉴定,制备所得CDV NP单克隆抗体与纯化的CDV NP抗原在预期的60 kd处有蛋白免疫印迹条带。该研究制备的单克隆抗体为后续犬瘟热的检测方法的研究奠定了基础。     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

mRuby2在原核细胞中的表达及纯化

采用PCR技术扩增mRuby2,将其插入原核表达载体p ET30a(+)中,用p ET30a(+)-mRuby2转化BL21(DE3)并诱导重组蛋白表达,用荧光显微镜及SDS-PAGE观察、检测目标蛋白的表达情况,以Ni亲和层析技术纯化重组蛋白。结果表明:构建的重组表达菌株经IPTG诱导后,发酵液颜色随诱导时间延长逐渐转为橙红,离心后的沉淀菌体为深粉红色,在荧光显微镜下,菌体发出明亮的红色荧光。SDS-PAGE检测发现,IPTG诱导5 h,重组蛋白表达量达到峰值。采用Ni螯合亲和层析技术从发酵菌体中分离出纯度大于80%的重组蛋白。由此可见:采用DNA重组技术能在原核系统中成功表达mRuby2编码的荧光蛋白,该重组蛋白亮度高、可视性好,能直观呈现实验结果,便于观察相关实验现象、理解并掌握实验原理,非常适合于生化、分子生物学实验教学。     

根癌农杆菌Atu5117基因原核表达载体的构建

为进一步提高农杆菌在植物转基因中的效率,构建一个原核基因表达载体,为农杆菌T-复合物招募蛋白VBP1的编码基因Atu5117的表达调控机理研究奠定基础。首先,通过聚合酶链式反应(PCR)获得Atu5117基因5’端上游具有转录活性的基因片段。然后,用绿色荧光蛋白基因(gfp)和493bp Atu5117启动子构成嵌合基因,体外构建原核表达载体PRSET-Agfp1,并转化到宿主细胞(大肠杆菌DH5α)。通过对绿色荧光蛋白(GFP)的跟踪观察,最终确定有启动子转录活性的基因片段。结果表明,该原核表达载体PRSET-Agfp1构建成功,为Atu5117基因的表达调控机理研究奠定基础。     

UFCI基因在乳腺细胞系中的表达分析

泛素结合酶UFC1是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2的基因。目前,对UFC1的功能研究报道还比较少,有待更进一步的研究和探讨。采用半定量RT-PCR技术分别检测一系列的乳腺细胞系MCF7、HBL100、MDA-MB231和MDA-MB-453中UFC1基因的转录水平,结果显示,在正常的HBL100乳腺细胞系中的表达最高,而在乳腺癌细胞系MCF7,MDA-MB231,MDA-MB-453中的表达明显降低。UFC1在乳腺细胞系中的差异表达的结果为将UFC1作为新的靶分子引入乳腺癌的临床预防和治疗提供实验依据。     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

骨髓间充质干细胞和干细胞因子在老年炎症性肠病的实验研究

目的探索骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)和干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)促进肠黏膜细胞分化增殖和再生的机制,提供治疗老年炎症性肠病的认识。方法 (1)建立动物模型:由吲哚美辛诱导的胃肠黏膜损害,供体雄性SD老年大鼠皮下注射吲哚美辛处理(7.5mg/kg在5%碳酸氢钠)24小时连续3天,取4只吲哚美辛处理的SD老年大鼠使用戊巴比妥麻醉条件下处死(50mg/kg,腹腔注射)细胞组织学评估和确认老年炎症性肠病模型成功建立。(2)成功建立的老年炎症性肠病模型动物被分成4组,每组16只:BMMSCs-SCF治疗组,BMMSCs治疗组,SCF治疗组和生理盐水对照组。(3)使用PKH26荧光染色标记骨髓间充质基质细胞,输入炎症性肠病受试SD老年大鼠实验模型中,通过形态学观察测定肠黏膜的修复及再生,采用Western blot和PCR技术对动物模型体内骨髓间充质基质细胞中PKH26的表达情况。结果在受体老鼠胃肠黏膜中发现PKH26荧光染色标记的骨髓间充质基质细胞,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),干细胞标记物(Lgr5,Musashi-1,ephrin-B3)等。在BMMSCs治疗组的SD老年大鼠肠黏膜中mRNA,PCNA的蛋白水平,Lgr5,Musashi-1和ephrin-B3增高,在BMMSCs-SCF混合治疗组中显著提高。在BMMSCs治疗组肠黏膜层和隐窝层浓度较高,更明显的在BMMSCs-SCF混合治疗组。结论在吲哚美辛诱导的肠道损伤实验中BMMSCs和SCF可能参与黏膜细胞再生并发挥协同作用。BMMSCs和SCF可能具有治疗价值。     

miR-590调控老年骨质疏松患者BMSCs成骨分化的研究

目的探讨miR-590在老年骨质疏松患者中的表达及其对BMSCs成骨分化的作用。方法收集老年骨质疏松患者(n=35)和骨质正常人(n=35)血清样本,检测miR-590的表达情况;培养老年骨质疏松患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)及正常BMSCs,成骨诱导21天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(ARS)和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验,检测成骨分化能力;并向老年骨质疏松患者BMSCs转染miR-590 mimic、mimic-NC、miR-590 inhibitor及inhibitor-NC,成骨诱导21天后检测成骨分化能力。结果 qRT-PCR实验表明,miR-590在老年骨质疏松患者血清和BMSCs中表达显著升高。此外,ALP染色、ARS和qRT-PCR实验表明,过表达miR-590抑制老年骨质疏松患者BMSCs的向成骨方向分化,而敲减miR-590促进老年骨质疏松患者BMSCs的向成骨方向分化。结论 miR-590抑制老年骨质疏松患者BMSCs成骨分化,敲减miR-590可能成为临床治疗老年骨质疏松的新方法。     

肝细胞靶向性Asor-PLL-DNA复合物的构建

目的 :构建肝细胞靶向性Asor PLL DNA复合物。方法 :将携带外源基因的质粒与脱唾液酸糖蛋白结合在一起 ,形成一种可溶性的蛋白 核酸复合物。结果 :该复合物能通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞作用 ,以非病毒感染的方式 ,将外源基因导入肝细胞并得以表达。结论 :和传统的重组病毒介导的基因转移方式相比 ,该复合物具有更高的靶向性、安全性 ,该系统的建立为以肝细胞为靶组织的外源基因介导的肝脏相关疾病的基因治疗提供实验基础。     

诱导小鼠破骨前体细胞成熟分化的实验条件探讨

目的 探讨小鼠单核细胞RAW264.7能否在RANKL诱导下向破骨细胞成熟分化.方法 RANKL作用RAW264.7细胞7天～9天,光镜、透射电镜、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)分别观察其细胞形态学变化,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察TRAP阳性的多核细胞,RT-PCR检测破骨细胞表型和功能基因表达变化情况,扫描电镜观察破骨细胞在骨片上形成骨吸收陷窝.结果 光镜、透射电镜下可见细胞胞体增大,为椭圆形或不规则形,胞核5～10个,扫描电镜下可见细胞表面大量的伪足样突起;此外,RANKL能诱导RAW264.7细胞分化为TRAP染色阳性的多核破骨细胞,细胞多为超过5个核的多核巨细胞;RAW264.7细胞成熟分化后具有骨吸收功能,并且能上调Cathepsin-K、TRAP、RANK等典型破骨细胞表型和功能基因mRNA的表达.结论 RAW264.7细胞是一种较好的破骨前体细胞模型,单用50ng/ml的RANKL体外连续诱导7天以上,能明显促进它向成熟的破骨细胞分化.     

积雪草酸抑制小鼠主动脉缩窄术后心肌肥厚形成

目的:观察积雪草酸(asiatic acid,AA)对小鼠主动脉弓缩窄术后心肌肥厚的保护作用并探讨其可能的机制?方法:采用主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)法建立小鼠心肌肥厚模型?实验分为5组:假手术组(Sham组)?手术组(TAC组)?TAC+AA1[25 mg/(kg?d)] 组?TAC+AA2[50 mg/(kg?d) 组?TAC+AA3[100 mg/(kg?d)] 组?TAC术后2周,心脏超声检测心功能,Western blot法检测心肌组织中转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1?p-p38?p38?p-ERK1/2以及ERK1/2蛋白的表达,real-time PCR法检测心肌组织中ANP和TGF-β1基因的表达?结果:AA可显著抑制TAC诱导的心肌肥厚,改善心功能,降低TGF-β1基因和蛋白表达,并抑制p38和ERK1/2磷酸化?结论:AA治疗可抑制心肌肥厚,其机制可能与AA抑制TGF-β1-p38/ERK1/2信号通路有关?     

杆状病毒核心基因ac78的克隆、表达与活性研究

杆状病毒核心基因ac78在杆状病毒的生活周期中具有重要作用。生物信息学分析发现,Ac78与斯氏假单胞菌的细胞色素C氧化酶cbb3-型亚基III具有一定的序列一致性,表明Ac78可能具有氧化酶活性,并在氧化还原反应中具有一定功能。用PCR的方法成功扩增得到ac78基因,该基因序列与GenBank上的苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV) ac78基因的核苷酸同源性100%,将其克隆至原核表达载体p QE30,构建了ac78基因原核表达质粒,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/L IPTG和低温诱导下超量表达了可溶性的目的蛋白。使用Ni-NTA Resin蛋白纯化树脂获得了较纯的含有6×His接头的Ac78蛋白,使用纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒测定其细胞色素C氧化酶活性,结果为阴性,表明Ac78可能不具有细胞色素C氧化酶活性。上述研究结果为深入探究Ac78的作用机理打下了坚实的基础。