烟草抗赤星病诱导中激发子对烟草几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的诱导作用

研究了激发子对烟草抗赤星病的诱导作用及诱导烟草几丁质酶、β－１，３－葡聚糖酶的积累情况．结果表明（１）激发子诱导后使烟草抗赤星病的能力提高５５．１３％，比水杨酸诱导效果低２１．８６％；（２）激发子诱导的β－１，３－葡聚糖酶和几丁质酶有明显的体外活性，二者单独使用时，酶活性单位分别为１．１６４和０．３１５ｕ，但二者混合作用时，酶的活性明显下降，活性单位分别为０．１２４和０．０５ｕ；（３）ＰＡＧＥ电泳显示，经激发子诱导后ＰＲ蛋白表达量远远超过对照，但比水杨酸诱导积累弱．可见，ＰＲ蛋白、β－１，３－葡聚糖酶、几丁质酶的积累与抗病诱导效果呈一致趋势，表明激发子诱导的烟草抗赤星病的作用可能与ＰＲ蛋白积累及这两种酶的诱导表达有关．     

ARF基因导入烟草的遗传转化研究

以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS+0.8 mg.L-16-BA+0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS+0.02 mg.L-1IBA+0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中.     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

产β-1,3-葡聚糖酶链霉菌菌株的筛选及其酶特性研究

从大白菜植株根际土壤中取样,通过茯苓粉琼脂培养基的透明圈试验,分离筛选到4株产β 1,3 葡聚糖酶的链霉菌菌株R8,R15,R31和AS.经比较发现,链霉菌菌株R15最早产生较明显的透明圈,且透明圈最大,澄清度最高.从R15菌株提取酶液,测定其分解β 1,3 葡聚糖的酶活力.结果表明,该酶作用的最适温度为55℃,最适pH为5 0;低于55℃,pH7 5以下,该酶较稳定;Fe3 ,K ,Cu2 ,Hg2 对酶有抑制作用,而Ca2 ,Fe2 ,Ba2 ,Mn2 ,Al3 及Zn2 对酶有激活作用.抑菌圈试验表明,该酶对小麦纹枯病菌具有很强的抑制作用,抑菌圈宽度达15mm.盆栽防病试验结果表明,小麦种子经酶液处理后,病根率为34 51%,防病效果为64 28%.     

番茄遗传转化体系的建立

为了获得带有白细胞介素2基因的转基因番茄植株,本研究运用农杆菌介导法,探究了影响遗传转化的因素,建立了较完善的番茄遗传转化体系。结果表明最优化的转化条件为:Km的筛选浓度为30mg/L,头孢曲松钠的抑菌浓度为500mg/L,侵染时间采用1~2min,并且抑菌7d后加入筛选压。得到的抗性植株经PCR检测为阳性,初步证明外源基因il-2已经整合到番茄基因组中。     

转AtMYB44基因小麦的获得和检测

为了评价拟南芥转录因子AtMYB44基因对小麦抗病能力的影响,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因作为选择标记,通过基因枪介导法将带有At-MYB44基因的表达质粒AF234296-44导入小麦品种扬麦158.经过2～3次甘露糖筛选后,获得75株再生苗.通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色获得40株CPR阳性再生苗,进一步通过标记基因PMI和目的基因AtMYB44的PCR检测,获得22株PCR阳性植株,转化率为0.306%.结果初步表明AtMYB44基因已整合到小麦基因组中,获得了生物安全标记的转AtMYB44基因小麦.     

基于矩阵打分值和化学位移值预测酶蛋白质中β-发夹模体

酶是一类具有催化功能的蛋白质,对其结构和功能的研究是非常有必要的。特殊模体β-发夹是一种简单的超二级结构,它们包含了丰富的折叠信息,对酶中β-发夹的预测有助于酶结构和功能的预测。本文建立了非冗余的β-发夹模体数据集,包含1080条酶蛋白质链,2818个β-发夹模体,1098个非β-发夹。提取位点亲疏水组分及位点亲疏水紧邻关联组分作为参数,运用矩阵打分算法得到的预测结果不理想。将位点亲疏水、位点亲疏水紧邻关联组分为参数得到的打分值和平均化学位移值共同作为特征参数,输入支持向量机算法对模体进行预测,5交叉检验预测总精度是81.8%,相关系数达到了0.636。     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶cDNA的克隆与序列分析

参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kaji-wara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.     

早衰因子及其突变对BACE1活性调控的研究

阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）是一种以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统退行性疾病,其典型病理特征为神经元胞外沉积的大量β淀粉样蛋（Amyloidβpeptide,Aβ）而形成的老年斑。Aβ是由β-淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）通过β-分泌酶（beta-site amyloidβprecursor protein cleaving enzyme1,BACE1）和γ-分泌酶有序切割产生的。而γ-分泌酶的活性中心早衰因子（Presenilin1,PS1）对BACE1的调控作用,可能对Aβ的产生发挥重要的作用。通过Western Blot和Real Time PCR的方法探讨了PS1缺失情况下,BACE1的表达水平以及活性,结果显示在MEF PS1敲除细胞中,BACE1的表达水平会显著下降,对APP的水解切割能力也会显著下调,当瞬时转染PS1后,这种现象会被翻转,BACE1的表达水平和mRNA水平均会显著上调。同时还发现在加入γ-分泌酶抑制剂L-685,458后,也可以很好的翻转MEF PS1^-/-PS2^-/-细胞中瞬时过表达PS1后所产生的影响。PS1突变L166P和Q223R可以显著性的增加APP的水解切割过程以及BACE1的表达水平以及活性,当加入γ-分泌酶抑制剂L-685,458后,能显著性的抑制PS1突变对BACE1的表达水平,活性以及mRNA水平。以上结果表明,PS1能够调控BACE1的表达水平,进而影响Aβ的产生。     

四聚1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮冠醚衍生物的合成

以二(碘乙基)醚与4,5-二氰乙硫基-1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮为起始原料,采用氰乙基保护与脱保护技术,通过多步缩合反应以较好的收率合成了含4个1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮并硫杂36-冠-12(5),给出了目标化合物的有效合成方法,并用1HNMR,MS和EA对其进行了表征.     

两株野生型枯草杆菌α-淀粉酶基因的克隆和测序

从土壤中筛选得到两株产α-淀粉酶的枯草杆菌QSH4株和SHX6株.根据枯草杆菌168株的淀粉酶基因设计引物,对QSH4、SHX6株的α-淀粉酶基因进行了克隆及测序.结果表明两株菌的α-淀粉酶基因碱基数目相等,均为1948bp.两者的碱基序列具有99.90%的同源性.QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶基因碱基均较168株酶基因缺失了35 bp(靠近3'-端),另有28个位点的碱基不同,与枯草杆菌168株α-淀粉酶基因之间有96.97%的同源性.由淀粉酶基因测序结果推测QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶蛋白由477个氨基酸组成.与168株的α-淀粉酶蛋白(660个氨基酸)相差183个氨基酸.由此推断酶活性中心可能位于酶分子的N-端的3/4肽段.     

小麦-簇毛麦端体附加系中6V端体的细胞遗传学行为及其在Moisson 6MV/6B中的传递

簇毛麦6V染色体上携有抗白粉病基因Pm21.本研究利用抗白粉病小麦-簇毛麦单端体和双端体附加系(2n=42+1t和2n=42+2t)为材料,通过自交,观察后代植株6V端体出现频率,以评价外源染色体在小麦背景中的遗传平衡程度及稳定性,为利用培育小麦-簇毛麦导入系提供理论依据.通过对自交群体植株根尖细胞染色体数观察,发现在双端体附加系(2n=42+2t)自交群体(F2)中,2n=42+2t,2n=42+1t,2n=42的出现频率分别为51.92%,40.38%和7.7%;在单端体附加系(2n=42+1t)的F2群体中,2n=42+2t,2n=42+1t,2n=42的出现频率分别为1.85%,17.59%和80.56%.χ2检验表明(χ20.01=0.000),两自交群体问6V端体传递能力存在显著差异,6V端体的传递能力与亲本携带的端体数密切相关,双端体附加系在减数分裂时主要形成n+t配子,而单端体附加系则形成n和n+t两种配子,n+t配子参与受精的竞争能力主要取决于6V端体的遗传平衡程度,单端体附加系自交群体中的6V端体出现频率较低.这表明6V端体可能携有较多的不利基因导致n+t配子竞争能力较差.小麦-簇毛麦6V双端体附加系Pana(2n=42+2t)6VS在Moisaon 6MV/6B中通过雌雄配子传递频率研究发现,6VS通过雌配子的传递频率(33.33%)远高于通过雄配子的传递频率(4.87%).这也与其抗病性鉴定结果一致.此外,还发现以Pana(2n=42+21)为母本获得了小麦-偏凸山羊草-簇毛麦三属杂种,而以Pana(2n=42+2t)为父本却未能获得小麦-偏凸山羊草-簇毛麦三属杂种,暗示Pana(2n=42+2t)附加端体可能对花粉育性有一定不利影响.     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

蛋白质β-发夹模体片断的识别

依据β-发夹氨基酸序列中的保守性特征,分别以氨基酸(20种氨基酸和一个空位)和氨基酸紧邻关联为参数,通过构建位置权重矩阵和选取氨基酸最佳序列模式片断,利用相似性打分函数,对蛋白质超二级结构β-发夹模体片断进行识别,获得了较好的预测效果.     

抗口蹄疫病毒phage-scFv及可溶性scFv的构建

利用重组DNA技术在抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C 7 VH基因和VL基因之间导入一段连接肽[(G ly4Ser)3],采用重叠延伸拼接法,经聚合酶链反应(PCR)扩增获得scF v基因。将scF v基因克隆至噬菌粒pCANTAB 5E载体,转化E.coli TG 1,构建噬菌体抗体文库。用M 13KO 7辅助噬菌体挽救及固相口蹄疫病毒(FMDV)抗原对噬菌体抗体文库的三轮“吸附-洗脱-扩增”的淘洗,筛选出scFv阳性克隆。将阳性克隆转化E.coli BH 2151,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导可溶性scFv蛋白的表达。酶联免疫吸附实验(EL ISA)检测表明:scFv克隆表达的phage-scFv及可溶性scFv与FMDV亲和力高,特异性强。     

龙眼果皮酶促褐变产物的提取、稳定性及抗氧化活性研究

为了研究龙眼果皮酶促褐变产物的最佳提取工艺、稳定性和抗氧化活性,以样品中总蒽醌含量为指标,通过单因素和正交试验法,考察乙醇的浓度、料液比、提取时间、提取温度4个因素对应用回流法提取褐变产物的影响,探讨提取龙眼果皮中酶促褐变产物的最佳工艺条件.采用分光光度法对褐变产物的稳定性和体外抗氧化活性进行了测定.结果表明,回流法提取酶促褐变产物最佳工艺条件为:乙醇浓度为70％,提取时间为8h,料液比为1∶2,提取温度为40℃.在试验温度范围内,酶促褐变产物比较稳定;但对光照比较敏感,尤其是在紫外光下稳定性较差;在酸性条件下的稳定性比在碱性和中性条件下好;在4种不同种类添加剂影响下,其稳定性均变差.体外抗氧化试验结果表明,龙眼果皮总蒽醌浓度为9.55 μg/mL时,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除率为74.1％;浓度为4.55 μg/mL时,羟基自由基(·OH)清除率达81.6％;浓度为6.70 μg/mL时,超氧阴离子自由基(·O2-)清除率达86.1％.回流法可提取龙眼果皮中酶促褐变产物.温度对酶促褐变产物稳定性影响不明显,光照、pH、食品添加剂因素影响其稳定性.酶促褐变产物具有一定的清除DPPH·、·OH和·O2-自由基的能力.     

吡格列酮对正常MC3T3-E1成骨细胞增殖、凋亡以及功能蛋白表达的影响

目的 探讨不同浓度吡格列酮(PIO)对正常糖浓度培养下MC3T3-E1小鼠早期成骨细胞增殖、凋亡及功能蛋白分泌表达的影响.方法 体外培养MC3T3-E1细胞,分为正常对照组、不同浓度PIO干预组(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L),分别干预24、48 h.CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RIA法和ELISA法分别检测相关功能蛋白骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP),RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、成骨因子runt相关基因2(Runx2)及骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达水平.结果 (1)与对照组比较,MC3T3-E1细胞增殖能力在5μmol/L PIO干预组增加显著(P<0.05)、在PIO大于5 μmol/L～10 μmol/L干预组则降低(P<0.05).干预时间由24 h延长至48 h,各组细胞增殖能力呈不同程度增加,但在20、40 μmol/L PIO干预的两组增加无统计学差别.(2)对照组及各PIO浓度干预干预24 h,细胞凋亡率分别为:1.97%、0.43%、13.0%、48.30%、81.00%;(3)随着PIO浓度从0～40μmol/、L范围内的增加,MC3T3-E1细胞的PPARγmRNA表达水平呈增加趋势(P<0.05);Runx2 mRNA表达量在5 μmol/L PIO浓度组时较对照组增加,在剂量较高时(PIO≥10 μmol/L)随浓度升高表达下降.(4)细胞功能蛋白ALP、OCN的分泌及BMP-2的表达在5 μmol/L PIO浓度组时最高,PIO≥10 μmol/L时,上述蛋白量逐渐下降(P<0.05);随干预时间从24～48 h延长,各PIO浓度干预组ALP以及BMP-2量增加(P<0.05),而OCN无显著改变(P>0.05).结论 PIO对正常糖浓度培养的MC3T3-E1细胞具有双向作用:低浓度促进细胞增殖,高浓度则促进凋亡.PPARγ适当激活可促使成骨细胞通过Runx2增加功能蛋白的合成;过度激活,则表现出细胞毒性.     

急性力竭运动后大鼠心肌细胞AngII受体表达的时间研究

目的：通过对急性力竭运动后不同时间大鼠心肌细胞血管紧张素Ⅱ受体AT,R和AT2R的表达变化以及心肌细胞凋亡进行研究,探讨血管紧张素Ⅱ受体与运动引起的心肌细胞凋亡之间的关系,揭示运动影响心脏的分子机制．方法：SD健康大鼠40只随机分为安静组（An=10）和力竭运动组（B,n=30）,B组在运动后又分为3个亚组即0h、6h和24h处死组．运动组大鼠进行运动速度为（25±2）m／rain,跑台坡度为0。力竭运动．应用RT—PCR法测定AIFmRNA的表达,TUNEL法测试心肌细胞凋亡指数,用Westernblotting方法测试心肌细胞ATlR和AT2R表达．结果：急性力竭运动后0h、6h和24hAIFrtlRNA表达量分别为6．69（P〈0．05）、9．32（P〈0．05）和10．82倍（P〈.．001）;运动后0h、6h和24hA1分别为（17．10±3．6）％（P〈0．001）、（33．3±10．4）％（P〈0．001）和（30．7±9．2）％（P〈0．001）;运动后0h、6h和24h心肌细胞ATlR蛋白表这分别增加5．16％（P〉0．05）、30．19％（P〈0．05）和64．44％（P〈0．05）而AT2R蛋白表达分别增加2．15％（P〉0．05）、10．12％（P〉0．05）和28．30％（P〈0．05）．结论：急性力竭运动后AT,R和AT2R表达增加,24h后仍然维持较高水平的表达;运动后AIFmRNA表达增加,运动后6h表达量达最大,24h开始下降．而ATlR和AT。R可能均参与介导急性力竭运动引起心肌细胞凋亡的过程．