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目的分析正常生育男性精细胞膜抗原 ,以便进一步应用精子抗原于其抗休的检测。方法 :1.精子膜抗原粗制方法 ,按“全国临床检验操作规程”(第二版 ,1998年 ,P398)描述的方法进行 ,即收集 2 0名正常生育男性精子样品 ,用含 0 .5 %NP - 40的Tris -Hcl缓冲液抽提。 2 .粗提液蛋白含量测定采用紫外分光光度法。 3.蛋白抗原纯化方法 ,采用冰冷乙醇沉淀法 ,以粗提液 :冰冷 95 %乙醇 (- 2 0℃ ) =1:9(v/v)混合 ,并按 1/ 5 0容量加入饱和乙酸钠混匀 ,于 - 2 0℃放置 4 8h。取出后于 - 10℃ ,180 0 g离心 30分钟 ,弃上清 ,倒放试管 ,沥干沉淀 ,- 2 0℃保存备用。 4 .SDS -PAGE分析 ,步骤 3所获样品 ,以NS溶解 ,通过紫外分光光度计测定含量 ,并调节到 6mg/ml。SDS -PAGE分析条件的点样量 2 5 μl,分离胶 17.5 % ,隔层胶 5 % ,电泳缓冲液用甘氨酸 -Tris,PH8.6,电压 2 0v过夜 ,次日再 15 0V4h。电泳后凝胶经考麦斯亮兰染色、乙酸 -甲醇洗脱 ,直至显示清晰电泳图谱。结果 :1、粗提液经紫外分光光度计测定 ,其原液含蛋白质为2 4mg/ml,最大吸收峰值 2 80nm。 2 .纯化的精子膜抗原溶液经SDS -PAGE分析 ,图谱显示 2个蛋白斑 ,与标准蛋白比较 ,其分子量一个为 35 - 45KD ,另一个为15 - 2 5KD ;75 - 85KD处出现微量痕迹。结? 相似文献
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