链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

姜荷花叶绿素降解酶基因PAO的分离及特征

姜荷花是国内新兴的一种热带花卉,其不育苞片尖端带有由叶绿素形成的绿色沉着,严重影响观赏效果.获得叶绿素降解关键酶基因信息有利于后期通过分子育种手段来改良苞片的颜色.为了获得叶绿素降解的关键酶基因PAO信息,本试验在前期通过姜荷花全长转录组测序获得大量转录组信息的基础上,进行筛选分析,获得了2条PAO基因,分别命名为PAO1和PAO2.PAO1基因(Gen Bank:MT077180),c DNA序列全长1 794 bp,开放阅读框1 611 bp(10 bp～1 620 bp),编码一条536AA的氨基酸序列.PAO2基因(Gen Bank:MT077181),c DNA序列全长1 843 bp,开放阅读框1 611 bp (10 bp～1 620 bp),编码一条536AA的氨基酸序列.PAO1和PAO2的氨基酸序列,仅存在4个氨基酸残基的差异.采用Blast,Translate tool(Ex PASy),Clustal Omega,Find Conserved Domains(NCBI),ProtParam,TMHMM Server,SOPMA,SWISS-MODEL,Clustal X(1.81),MEGA4.1等预测和分析了这2个基因编码蛋白氨基酸的一级结构(包括氨基酸序列的组成、保守区、理化特征等)、二级结构、三级结构及分子系统进化关系.PAO1和PAO2的核苷酸与蛋白氨基酸序列与其他物种的PAO基因都具有很高的同源性,两者都包含PLN02518的保守区.分子系统进化分析表明,姜荷花的PAO1和PAO2组成的小类,与小果野芭蕉PAO(XP_009398041.1)的亲缘关系最为接近,然后与禾本科植物的PAO聚为一大类.本研究为后期通过分子手段改良姜荷花不育苞片的颜色提供基础,并为进一步丰富和探索叶绿素降解代谢理论提供铺垫.     

雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶cDNA的克隆与序列分析

参照Kajiwara等人获得的β-胡萝卜素酮化酶cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶cDNA的完整编码片段并进行了序列测定与分析.结果表明,所获得cDNA序列与Kaji-wara等人报道序列具有96.4%的相似性,蛋白序列具有98.3%的相似性,说明所获得的cDNA序列确为β-胡萝卜素酮化酶的cDNA序列.     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.     

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS24(Ribosomal Protein S24)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫RPS 24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15.3251kD,pI为10.92,含有7种类型共14个功能位点:即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e sig-nature.进一步分析发现,大熊猫RPS 24基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为94.1%、92.4%、94.7%、89.9%和90.4%;与人RPS 24蛋白的氨基酸序列同源性为98.48%,其余均为99.24%.     

一种手性金鸡纳季铵盐的合成及催化α,β-不饱和酮的Michael加成反应研究

间-二溴甲基苯与辛可尼定在EtoH-DMF-CHCI3,混合溶剂中回流6-～7h,得到溴化α,α'-双辛可尼定-m-二甲苯,产率70%.将其用于催化查尔酮与丙二酸二乙酯的Michael加成反应,获得了最高产率70%,最大e.e%值为89%的对映选择性.     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料,采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN;用磁珠法分离得到纯化的mRNA;在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA;经与质料载体重组和转化大肠杆菌,成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库.经检测,文库存容量达106,重组率为88.21%.测序结果表明:克隆片段长度一般都大于600 bp,说明构建的文库质量较高,能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要,为进一步研究奠定了很好的物质和技术基础.     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位.甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础.本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession:JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测.将获得的PGIP基因命名为BoPGIP.该基因DNA全长为1065bp,包含1个内含子和2个外显子.外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26.该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65～68,106～109,130～133,254～257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189～191),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(73～76,78～81,151～154,182～185,304～307)和4个N-豆蔻酰化位点(157～162,188～193,236～241,273～278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79％helix,13.89sheet和54.32％loop,二级结构以无规则卷曲为主.通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础.     

人类SSX基因族简介

人类的SSX基因家族包括5个成员:SSXl,SSX2,SSX3,SSX4和SSX5,它们都位于X染色体上.这5个基因有很高的序列同源性:碱基序列有88%-95%同源;所编码188个氨基酸残基构成的蛋白质有77%-91%同源.它们所编码的蛋白质中含有KRAB(Kruppel associated box).SSX蛋白质也是癌/睾丸抗原(CT:Cencer/testis antingns)中的成员.研究SSX基因结构、基因表达等对于肿瘤免疫疗法的建立具有重要意义.     

肌醇及其代谢关键酶基因与植物逆境响应机制的研究进展

肌醇在植物的抗逆过程中发挥着重要的作用,参与肌醇的合成代谢的关键酶是肌醇-1-磷酸合酶(MIPS)和肌醇加氧酶(MIOX).本文就肌醇的发现、肌醇的代谢、肌醇的生理作用及代谢关键酶的编码基因的研究展开综述,介绍了肌醇关键酶基因的研究在植物抗逆研究中的重要意义,并讨论这一领域研究中存在的问题和今后的发展应用趋势.     

两株野生型枯草杆菌α-淀粉酶基因的克隆和测序

从土壤中筛选得到两株产α-淀粉酶的枯草杆菌QSH4株和SHX6株.根据枯草杆菌168株的淀粉酶基因设计引物,对QSH4、SHX6株的α-淀粉酶基因进行了克隆及测序.结果表明两株菌的α-淀粉酶基因碱基数目相等,均为1948bp.两者的碱基序列具有99.90%的同源性.QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶基因碱基均较168株酶基因缺失了35 bp(靠近3'-端),另有28个位点的碱基不同,与枯草杆菌168株α-淀粉酶基因之间有96.97%的同源性.由淀粉酶基因测序结果推测QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶蛋白由477个氨基酸组成.与168株的α-淀粉酶蛋白(660个氨基酸)相差183个氨基酸.由此推断酶活性中心可能位于酶分子的N-端的3/4肽段.     

四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cyt b基因的克隆及其比较研究

为揭示2003年在王朗采集的鼢鼠标本王03001号是否为秦岭鼢鼠四川兽类新纪录,以鼢鼠标本王0300号的肌肉组织为研究材料,运用PCR技术对其线粒体Cyt 6基因进行克隆和测序.结果表明该基因的长度为1140bp,编码380个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白质含有2个N-糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,6个N-豆蔻化位点.再以已研究的鼢鼠6个种18个体Cyt b基因序列及氨基酸序列为基础数据,把中华竹鼠(Rhizomys sinensis)作为外群,结合本研究的结果构建系统发育树,所得结果不支持王03001号标本为秦岭鼢鼠.     

人类新基因CHID1的克隆与功能初步研究

使用生物信息学手段,从人公共蛋白质数据库的蛋白质序列中筛选到新的分泌蛋白基因CHID1(Chitinase domain containing 1),该基因定位于人11号染色体短臂15区5带(11p15.5),cDNA长1 182 bp,其编码蛋白共有393个氨基酸。转染COS-7细胞后Western blot实验显示:在细胞培养液中没有检测到CHID1蛋白。对CHID1基因在mRNA水平上进行组织分布考察发现:它在肺、肾、肝、心、胸腺中都有表达,肝中最高。细胞生长曲线揭示,Lovo-CHID1稳定细胞株有生长抑制的现象,而细胞周期分析发现细胞株在G1期发生阻滞。这表明CHID1有可能是个潜在的抑癌基因。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

新型含色酮异噁唑类去甲斑蝥素衍生物的合成

主要介绍一种新型含色酮结构异噁唑类去甲斑蝥素衍生物的制备方法,该制备方法用1,3-偶极环加成方法在去甲斑蝥素结构中的C5和C6位引入异噁唑环,与色酮衍生物反应导入色酮结构,从而合成一系列的共5个新型的含有色酮结构的异噁唑类去甲斑蝥素衍生物.     

三角帆蚌一种新型SOD基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆到了一个新型超氧化物歧化酶基因(命名为Hc SODn).Hc SODn基因的长度为1575 bp,包括一个长804 bp的开放阅读框,编码267个氨基酸的蛋白,并含有一个保守的Cu_Zn_SOD结构域.Hc SODn mRNA在所检测的三角帆蚌的各个组织中均有表达,而腮中最高.在嗜水气单胞菌诱导下,血细胞中的Hc SODn mRNA的表达水平在3 h时显著上调(P0.05),表明Hc SODn在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥重要作用.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genesean软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

油茶油脂的生物合成及调控基因的特性

茶油在种子内主要以油体形式存在,因而油体蛋白的数量与种类决定了油体的数量与特性,在长期进化中油体蛋白基因失去了内含子,可促进油体蛋白的快速表达.茶油生物合成过程中涉及了大量酶与蛋白质的参与,其中丙二酸单酰C oA决定了饱和脂肪酸的合成速度;硬脂酰ACP脱饱和酶直接控制不饱和脂肪酸的含量;油酸脱饱和酶控制多不饱和脂肪酸的含量与种类.还需克隆相关基因的全长cDNA,并通过分子生物学技术确定这些基因的功能与调控机理.     

基于物化特性编码和离散增量的支持向量机方法预测酶的亚类

从酶序列出发,提出了一种新的酶的亚类的预测方法。利用物化特性编码和离散增量得到特征向量来表示序列信息,并将这些特征向量输入支持向量机,对酶的6个家族类中各自的亚类进行分类。在Jacknife检验下,氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶和连接酶中包含的亚类得到的预测精度分别为96.2%,99.2%,99.6%,95.3%,94.4%和97.7%。该方法得到的预测结果优于其它方法。     

一种新的与渗调蛋白基因启动子结合的蛋白基因的分离

渗调蛋白基因可受多种外界环境因子的诱导表达,并与植物细胞的渗透调节、抗逆境及植物抗病性等重要的生理过程有着密切关系,通过寻找与渗调蛋白基因启动子中FA区域DNA结合的蛋白,克隆参与该基因表达调控的反式作用因子,有利于明确渗调蛋白基因在转录水平上的调控机制,揭示外界环境因子通过信号传导系统诱导渗调蛋白基因表达的过程。利用近年来发展起的酵母单杂交系统,从适盐的烟草悬浮细胞的cDNA文库中分离到1个可与渗调蛋基因启动子中FA片段结合的蛋白因子的基因OPBP1。核酸序列分析表明OPBP1包含有一个完整的阅读框架,可编码277个氨基酸,氨基酸序列的比较分析表明该蛋白与近年来发现的一类新的DNA结合蛋白如EREBP,AP,ANT等具有相同的保守区,其中一些氨基酸完全相同,OPBP1与EREBP3最接近,同属该类新的DNA结合蛋白的第1组,仅有1个保守区。