建立一个基于报告基因的靶标筛药系统筛选上调ABCA1基因转录的中药提取物

ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)具有催化外周细胞过量胆固醇和磷脂外向流出的功能。本实验将ABCA1启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,并将得到的重组质粒pGL3B-neo/ABCA1转染入人肝癌细胞(hepG2)。通过稀释培养法最终得到含有重组质粒的稳定细胞系SABCA1。利用这个报告基因为基础的药物筛选系统,筛选了100多种中药提取物。通过荧光素酶活性测试,相对活性达到180%以上的有4种中药提取物,并最终挑选能明显激活ABCA1基因启动子的鬼箭羽水提组分进一步研究,得出半数有效浓度(EC50)为48.06 mg/L。此外,利用基于apoA1基因的药物筛选系统验证得出鬼箭羽水提组分也能促进apoA1基因的表达。     

基于报告基因能筛选下调p66~(shc)基因转录的药物普筛系统的建立

将p66shc基因的启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,然后将重组质粒pGL3B-neo-p66shc转染入人的肺癌细胞A549中,通过单集落分离法得到含有重组质粒的稳定细胞系A549/p66shc。利用这个以报告基因为基础的药物普筛系统,筛选了数百种中药提取物及单体化合物,发现抑制率达到50%以上的2种中药提取物和8种单体化合物。     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

利用CRISPR/Cas9双质粒系统构建Nissle 1917ΔcheZ基因缺失株

为研究趋化性基因cheZ对大肠杆菌益生菌Nissle 1917的影响,研究以敲除大肠杆菌Nissle 1917的cheZ基因为目的.首先,利用诺唯赞ClonExpress?MultiS一步克隆试剂盒构建pTargetTΔcheZ重组质粒,随后将pTargetTΔcheZ重组质粒电转入含pCas质粒的Nissle 1917感受态中,以实现对大肠杆菌益生菌Nissle 1917染色体中cheZ基因进行靶向敲除,经PCR鉴定和基因测序双重证实,Nissle 1917基因组中的cheZ基因已敲除.最后,经IPTG诱导和高温培养,消除缺失株中的pTargetTΔcheZ和pCas 2个质粒,最终获得趋化性基因cheZ缺失株Nissle 1917ΔcheZ.本试验为验证cheZ基因在益生菌Nissle1917中的生物活性及其扮演的基因功能的后续相关研究打下了前期基础.     

以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n(pGL-MDR1)∶n(pRL-TK)=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

应用图像分析技术评估胃腺癌细胞增殖、DNA倍体与淋巴结转移的关系

目的:应用图像分析技术观察胃腺癌细胞DNA倍体平均含量、细胞增殖状况,评估其与胃腺癌淋巴结分期、淋巴结转移数目的关系.方法:收集根治性手术切除的胃腺癌标本69例,经Feulgen染色,采用计算机图像分析系统对胃腺癌细胞DNA倍体平均含量、细胞增殖状况进行定量分析,观察其与胃腺癌淋巴结转移的关系.结果:N0、N1、N2、N3组胃腺癌细胞DNA异倍体平均含量、增殖期细胞数量随淋巴结转移数目增高而依次升高,在有无淋巴结转移以及转移淋巴结个数之间差别有统计学意义(P<0.05).结论:胃腺癌细胞DNA异倍体含量高、进入S/G2/M期细胞多者,淋巴结转移发生率高,且与胃腺癌UICC/AJCC的淋巴结转移分期呈正相关,评估胃腺癌细胞增殖、DNA倍体状况对提示淋巴结转移的程度有重要的指导意义.     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

siRNA抑制大鼠心肌细胞MagT1基因表达的研究

目的： Mg2＋是活细胞中含量最丰富的二价阳离子之一,是多种酶的辅助因子,还是维持大分子有活性的构象,脂类和磷酸肌醇类第二信使的调控,多种离子通道和转运体的调控所必需的在哺乳动物细胞生命活动中起着重要作用。临床观察表明,心肌细胞内游离Mg2＋浓度过低时会导致心律失常等现象。为了深入研究MagT1基因在心肌细胞中的功能,本研究试图确定沉默效果好的MagT1 siRNA,为后续实验奠定基础。方法体外分离大鼠心肌细胞,并检验心肌细胞的纯度;委托上海吉玛生物技术公司设计4对siRNA,与转染试剂混合并转染进大鼠心肌细胞,使用RT-PCR方法检测siRNA沉默MagT1基因的效果。结果经过RT-PCR的检测,发现4对siRNA中只有1对siRNA沉默效果最好,序列为5′-GAUUGGACUUGUUGUGUUATT-3′;5′-UAACACAACAAGUCCAAUCTT-3′。结论找到了沉默效果好的siRNA,为使用RNA干扰方法深入研究MagT1的功能奠定了基础。     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

肝细胞靶向性Asor-PLL-DNA复合物的构建

目的 :构建肝细胞靶向性Asor PLL DNA复合物。方法 :将携带外源基因的质粒与脱唾液酸糖蛋白结合在一起 ,形成一种可溶性的蛋白 核酸复合物。结果 :该复合物能通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞作用 ,以非病毒感染的方式 ,将外源基因导入肝细胞并得以表达。结论 :和传统的重组病毒介导的基因转移方式相比 ,该复合物具有更高的靶向性、安全性 ,该系统的建立为以肝细胞为靶组织的外源基因介导的肝脏相关疾病的基因治疗提供实验基础。     

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.     

阿司匹林对人结肠癌耐药细胞株Caco-2增殖和凋亡的影响

目的研究阿司匹林对人结肠癌耐药细胞株Caco-2增殖和凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定阿司匹林对Caco-2增殖抑制的影响,流式细胞术（FCM）法检测细胞凋亡指数,电镜等技术。结果不同浓度的阿司匹林对人结肠癌耐药细胞株Caco-2有较强的抑制作用,且呈剂量及时间依赖性。结论阿司匹林能够显著抑制人结肠癌耐药细胞株Caco-2增殖及诱导凋亡。     

微生物发酵生产赖氨酸的研究进展

赖氨酸是用发酵法生产的一种人体及动物必需氨基酸,被广泛地用于医药、营养食品和饲料等方面。文章概括了近几年用全球微生物发酵生产赖氨酸的概况,并介绍了由基因重组、基因扩增的方法,包括用可检测识别的染色体DNA重组,利用可检测识别的杂交质粒进行目的基因重组,用PCR技术扩增目标基因的重组等生物技术进行的赖氨酸生产菌株的研究进展。对ε-聚赖氨酸这种新型防腐剂、乳化剂、食疗剂的微生物发酵生产菌的选育及其生产和应用进行了综述。     

密穗马先蒿提取物对小鼠血液学指标的影响

观察密穗马先蒿提取物对运动小鼠血液学指标的影响,探讨其对运动引起贫血的保护作用.4周龄昆明种小鼠随机分为对照组、运动组、阳性对照组、密穗马先蒿组.运动组、阳性对照组和密穗马先蒿组进行4周的游泳训练,最后一次力竭游泳后采用心脏取血,肝素抗凝,运用血细胞分析仪测定血液学指标.实验4周后,运动组小鼠RBC、Hb和HCT均低于其他3组,呈显著性差异(P<0.05),但对照组、阳性对照组、密穗马先蒿组之间比较差异无显著性(P>0.05);运动组MCV显著大于其他3组,呈显著性差异(P<0.01),其他3组之间比较无显著性差异(P>0.05).结果表明密穗马先蒿具有改善大强度训练所引起的小鼠RBC、Hb、HCT、MCV等改变.     

耐力训练大鼠心肌基因谱改变及壳寡糖预处理效应

研究大强度耐力训练大鼠心肌组织基因表达谱的改变,筛选与心肌损伤过程相关的差异表达基因;观察壳寡糖预处理效应,探讨壳寡糖作为抗疲劳强力因子保护心肌结构和功能的分子机制.分别从对照组、壳寡糖处理组、耐力训练组SD大鼠的心肌组织中抽提总RNA.Cy3、Cy5荧光标记,反转录分别合成cDNA探针后,与含有12 000个基因的SBC大鼠高密度12K基因表达谱芯片杂交.杂交信号经扫描后,Genespring软件分析表达信号.差异表达基因共616个,大强度耐力训练组差异表达基因157个,其中上调141个,下调17个;壳寡糖处理组差异表达基因459个,其中上调183个,下调276个,涉及细胞凋亡差异表达基因有36个,下调24个,上调12个.结论：耐力运动所引起的心肌结构和功能的积极适应甚或心肌损害都是由众多基因共同调控的复杂过程.壳寡糖能调控大强度耐力训练大鼠心肌组织多种功能类别基因群表达水平,从分子水平揭示了壳寡糖保护大强度耐力训练对大鼠心肌造成不良影响的作用机制.     

螺旋藻复方对疲劳大鼠血液形态学参数的影响

观察螺旋藻复方中药对慢性疲劳大鼠红细胞形态学参数的影响,探讨其在预防运动性贫血中的作用.将21只大鼠分为对照组、运动组和运动 复方组(简称复方组).对照组不作任何处理,运动组和复方组进行8周的递增性跑台训练,复方组从第5周开始灌胃中药.训练结束后,测定各组大鼠血液中红细胞计数(RBC)血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)进行统计学的方差分析.(1)与对照组相比运动组的RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC6项指标中只有MCV显著高于对照组(P＜0.01)其它5项指标显著下降(P＜0.05)或(P＜0.01).(2)复方组大鼠RBC和MCHC水平高于运动组(P＜0.05),HGB和MCH水平显著高于运动组(P＜0.01).(3)复方组与对照组比较6项指标均无显著差异.结果表明螺旋藻复方对保护红细胞防止运动性贫血的发生有积极作用.     

TWIST基因和蛋白与宫颈癌发生发展关系的研究

目的:检测TWIST基因在宫颈癌组织和宫颈正常组织中的表达,探讨其与宫颈癌发生?发展的相关性及在宫颈癌诊疗中的意义?方法:收集56例宫颈癌组织和35例宫颈正常组织,用实时定量PCR检测TWIST mRNA的表达;用Western blot检测TWIST蛋白的表达,并分析TWIST mRNA在宫颈癌中的表达水平与临床病理因素及高危型HPV病毒载量相关性?结果:实时定量PCR结果显示宫颈癌组织中TWIST mRNA表达高于宫颈正常组织,差异具有统计学意义(P < 0.01);Western blot在蛋白质水平上证实了这一点(P < 0.01)?宫颈癌组织中TWIST的表达与淋巴结转移相关(P = 0.022),但与年龄?FIGO分期?肿瘤大小?病理类型?肿瘤分化程度无关(P均> 0.05),Logistic回归分析显示,高水平的TWIST mRNA表达是淋巴结转移的独立危险因子(P < 0.05)?而TWIST基因的相对表达水平与高危型HPV病毒载量无相关性(r = 0.205,P > 0.05)?结论:宫颈癌组织中TWIST的表达上调,且与是否有淋巴结转移相关,TWIST的表达可能对宫颈癌的发生?发展及转移有重要作用?     

北京地区汉族人群ITGA6基因多态性与前列腺癌的易感性研究

目的探讨北京地区汉族人群中ITGA6基因多态性与前列腺癌遗传易感性的关系。方法采用病例对照研究,提取121例前列腺患者(病例组)和136例非前列腺癌健康人(对照组)外周血中基因组DNA,采用聚合酶链反应-高分辨熔解曲线(PCR-HRM)技术结合测序验证法检测其ITGA6基因rs12621278单核苷酸多态性的分布情况,分析ITGA6基因多态性与前列腺癌的相关性。结果①前列腺癌组中AA,AG,GG基因型分别为69例(57%),40例(33.1%),12例(9.9%);正常对照组中AA,AG,GG基因型分别为69例(50.7%),55例(40.4%),12例(8.8%)。②ITGA6基因rs12621278单核苷酸多态性的三种基因型频率在前列腺癌组和正常对照组间的分布无显著差异(χ2=1.498,P=0.473),两种等位基因频率在两组间的分布也无显著差异(χ2=0.43,P=0.512)。结论 ITGA6基因rs12621278单核苷酸多态性与北京地区汉族人群前列腺癌的发生无明显相关性,可能与中国人前列腺癌发病风险无关。