大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT-PCR技术,首次从大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS24(Ribosomal Protein S24)基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫RPS 24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15.3251kD,pI为10.92,含有7种类型共14个功能位点:即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e sig-nature.进一步分析发现,大熊猫RPS 24基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为94.1%、92.4%、94.7%、89.9%和90.4%;与人RPS 24蛋白的氨基酸序列同源性为98.48%,其余均为99.24%.     

姜荷花叶绿素降解酶基因PAO的分离及特征

姜荷花是国内新兴的一种热带花卉,其不育苞片尖端带有由叶绿素形成的绿色沉着,严重影响观赏效果.获得叶绿素降解关键酶基因信息有利于后期通过分子育种手段来改良苞片的颜色.为了获得叶绿素降解的关键酶基因PAO信息,本试验在前期通过姜荷花全长转录组测序获得大量转录组信息的基础上,进行筛选分析,获得了2条PAO基因,分别命名为PAO1和PAO2.PAO1基因(Gen Bank:MT077180),c DNA序列全长1 794 bp,开放阅读框1 611 bp(10 bp～1 620 bp),编码一条536AA的氨基酸序列.PAO2基因(Gen Bank:MT077181),c DNA序列全长1 843 bp,开放阅读框1 611 bp (10 bp～1 620 bp),编码一条536AA的氨基酸序列.PAO1和PAO2的氨基酸序列,仅存在4个氨基酸残基的差异.采用Blast,Translate tool(Ex PASy),Clustal Omega,Find Conserved Domains(NCBI),ProtParam,TMHMM Server,SOPMA,SWISS-MODEL,Clustal X(1.81),MEGA4.1等预测和分析了这2个基因编码蛋白氨基酸的一级结构(包括氨基酸序列的组成、保守区、理化特征等)、二级结构、三级结构及分子系统进化关系.PAO1和PAO2的核苷酸与蛋白氨基酸序列与其他物种的PAO基因都具有很高的同源性,两者都包含PLN02518的保守区.分子系统进化分析表明,姜荷花的PAO1和PAO2组成的小类,与小果野芭蕉PAO(XP_009398041.1)的亲缘关系最为接近,然后与禾本科植物的PAO聚为一大类.本研究为后期通过分子手段改良姜荷花不育苞片的颜色提供基础,并为进一步丰富和探索叶绿素降解代谢理论提供铺垫.     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

重庆两株H5N1流感病毒的HA、NA基因克隆及序列分析

2012年,从重庆北碚区和巴南区的家禽养殖场死鸭和病鸡体内分离出两株H5N1禽流感病毒,分别命名为A/duck/Chongqing/BB/H5N1和A/chicken/Chongqing/BN/H5N1,并对这两株H5N1禽流感病毒的HA、NA和M蛋白的基因进行了克隆及序列分析,在基因和蛋白质水平上分析其同源性。遗传进化树分析结果表明:这两毒株的HA、NA和M基因不处于同一支上,亲缘关系较远;这两毒株的HA、NA、M蛋白的基因同源性分别达95%,95%,97%;两毒株的HA蛋白裂解位点氨基酸序列均为RERRR-KR,符合高致病性禽流感的特征。本次分离的流感病毒的基因克隆鉴定和序列分析为禽流感的流行病学研究、疫苗研制以及防控提供重要理论依据。     

人类SSX基因族简介

人类的SSX基因家族包括5个成员:SSXl,SSX2,SSX3,SSX4和SSX5,它们都位于X染色体上.这5个基因有很高的序列同源性:碱基序列有88%-95%同源;所编码188个氨基酸残基构成的蛋白质有77%-91%同源.它们所编码的蛋白质中含有KRAB(Kruppel associated box).SSX蛋白质也是癌/睾丸抗原(CT:Cencer/testis antingns)中的成员.研究SSX基因结构、基因表达等对于肿瘤免疫疗法的建立具有重要意义.     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况.采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达.分离到DFR,该cDNA全长1267bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸.序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75％～80％.系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近.半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到.原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达.从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成.     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolorA3(2),Streptomyces maritimus,Streptomyces mycarofaciensATCC 21454和Streptomycessp.Tü4128)中分别被克隆。测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性。将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生。将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9。     

四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cyt b基因的克隆及其比较研究

为揭示2003年在王朗采集的鼢鼠标本王03001号是否为秦岭鼢鼠四川兽类新纪录,以鼢鼠标本王0300号的肌肉组织为研究材料,运用PCR技术对其线粒体Cyt 6基因进行克隆和测序.结果表明该基因的长度为1140bp,编码380个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白质含有2个N-糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,6个N-豆蔻化位点.再以已研究的鼢鼠6个种18个体Cyt b基因序列及氨基酸序列为基础数据,把中华竹鼠(Rhizomys sinensis)作为外群,结合本研究的结果构建系统发育树,所得结果不支持王03001号标本为秦岭鼢鼠.     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

α-淀粉酶在D201GF树脂上的吸附性能研究

应用D201GF阴离子交换树脂吸附固载α-淀粉酶.研究了D201GF阴离子交换树脂对水溶液中α-淀粉酶的吸附热力学和吸附动力学特性.分析了体系温度、pH值和离子强度对α-淀粉酶吸附的影响.热力学研究表明,α-淀粉酶在D201GF阴离子交换树脂上的吸附平衡数据遵循Langmuir吸附等温方程,过程吸热.较高的温度、较低的pH值和离子强度均有利于α-淀粉酶的吸附.动力学研究显示,D201GF阴离子交换树脂对α-淀粉酶的吸附过程主要受内扩散控制.     

三角帆蚌一种新型SOD基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆到了一个新型超氧化物歧化酶基因(命名为Hc SODn).Hc SODn基因的长度为1575 bp,包括一个长804 bp的开放阅读框,编码267个氨基酸的蛋白,并含有一个保守的Cu_Zn_SOD结构域.Hc SODn mRNA在所检测的三角帆蚌的各个组织中均有表达,而腮中最高.在嗜水气单胞菌诱导下,血细胞中的Hc SODn mRNA的表达水平在3 h时显著上调(P0.05),表明Hc SODn在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫反应过程中发挥重要作用.     

甘蓝多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白BoPGIP基因的克隆及序列分析

PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的细胞壁结合蛋白,在植物分子抗病育种中占有十分重要的地位.甘蓝PGIP基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病甘蓝新品种奠定基础.本研究通过同源序列克隆法,根据GenBank已登录的青花菜BoPGIP1(Accession:JF325875)基因全长序列设计基因特异性引物,利用PCR扩增技术从甘蓝中克隆基因,利用生物信息学的方法对其编码蛋白的结构和功能进行了预测.将获得的PGIP基因命名为BoPGIP.该基因DNA全长为1065bp,包含1个内含子和2个外显子.外显子全长975 bp,编码342个氨基酸,分子量为36.2 kD,等电点是6.26.该基因属于PGIP基因家族,具有典型的LRR结构域;功能位点分析显示编码蛋白序列中包括4个N-糖基化位点(65～68,106～109,130～133,254～257),1个蛋白激酶C磷酸化位点(189～191),5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(73～76,78～81,151～154,182～185,304～307)和4个N-豆蔻酰化位点(157～162,188～193,236～241,273～278);N末端具有一明显跨膜区域和一个典型信号肽序列;二级结构中包含31.79％helix,13.89sheet和54.32％loop,二级结构以无规则卷曲为主.通过对所克隆的甘蓝BoPGIP基因分析可知,该基因属于PGIP基因家族的新成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证甘蓝BoPGIP的功能奠定了基础.     

基于NCBI核酸数据库资源的黑曲霉微卫星序列的筛选

为了筛选黑曲霉微卫星序列,丰富黑曲霉的基因组资料,从而为开发黑曲霉多态性高的微卫星标记提供参考,本研究利用生物信息学方法在黑曲霉基因组中查询微卫星序列,并对其基因组中微卫星数量、丰度进行了研究.利用SSRHunter 1.3在长度为2704975 bp的黑曲霉基因组中找到了171个微卫星序列.结果表明:在黑曲霉微卫星序列所有重复类型中,以两碱基重复数目最多,为92个,占重复序列总数目的 53.80%;其次是三碱基重复,为70个,占40.94%;再次是四碱基9个,占5.26%.在两碱基重复序列中,AG重复类型最多(24.56%),GC最少(1.17%).三碱基重复序列中,共发现10种重复类别,其中以ACC重复类型最多(7.01%),最少的是AAT,ATC和GCC,占1.75%.四碱基重复中,共发现8种重复类别,除GGAT重复序列为2个(1.17%)外,其他分别各有1个(0.58%).同时选取黑曲霉中二碱基的重复次数在七次以上的微卫星序列和三碱基的重复次数在六个以上的微卫星序列,利用Primer Premier5.0软件来设计引物,为后续微卫星标记的筛选奠定基础.     

硫氧还蛋白及其L79K变体酶切后片段自身重新结合为同源二聚体的稳定性和动力学研究

本文选择硫氧还蛋白 (TRX)和硫氧还蛋白变体 (TRXL79K)分别酶切后得到的两个片段 :N片段 (1 -73 )和 C片段 (74-1 0 8)作为研究对象 .在硫氧还蛋白变体中用赖氨酸代替原来 79位的亮氨酸 ,对两组 N片段和 C片段在自然状态下重新结合的稳定性和动力学进行对比 ,得到以下结论 :1 .TRX中处于 β折叠状态的 β4区域 (P76,T77,L78,L79,L80 ,F81和 K82 ) 〔3〕中氨基酸的改变对 N片段和 C片段重新聚合成非共价键聚合物的动力学过程有一定的影响 .2 .79位氨基酸的改变对N片段和 C片段形成非共价键同原二聚体的稳定性有较大的影响 .     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料,采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN;用磁珠法分离得到纯化的mRNA;在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA;经与质料载体重组和转化大肠杆菌,成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库.经检测,文库存容量达106,重组率为88.21%.测序结果表明:克隆片段长度一般都大于600 bp,说明构建的文库质量较高,能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要,为进一步研究奠定了很好的物质和技术基础.     

基因组中的基因家族

在人及高等有机体基因组中,有许多基因家族。有的基因家族成员多,有的基因家族成员少;有的基因家族成员功能相似,有的基因家族成员功能各异。所谓多基因家族是指一类具有序列同源性及相似功能的基因;而基因超家族是指一类具有序列同源性而不具相似功能的基因。如果一类蛋白或基因具有共同起源的一个结构域,就属于一个基因超家族,同一个基因可归属于两个或多个基因超家族。     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genesean软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

烟草硫氧还蛋白基因NtTRX-hl的克隆和功能分析

从烟草中克隆了硫氧还蛋白基因NtTRX-hl并推导出其氨基酸序列,系统进化关系分析表明,NtTRX-hl与小麦、大麦、拟南芥等多种植物的TRX蛋白有很高的同源性.构建高效表达载体,诱导表达重组菌得到分子大小为22.26 kD的融合蛋白,与推测的分子量一致.用胰岛素和二硫苏糖醇作底物进行酶活性测定表明,Nt-TRX-hl具有活性.采用生物信息学的方法和工具分析了NtTRX-hl蛋白的生化参数和亚细胞定位,预测了该蛋白的高级结构.