建立一个基于报告基因的靶标筛药系统筛选上调ABCA1基因转录的中药提取物

ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)具有催化外周细胞过量胆固醇和磷脂外向流出的功能。本实验将ABCA1启动子序列克隆到含有荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的pGL3B-neo载体中,并将得到的重组质粒pGL3B-neo/ABCA1转染入人肝癌细胞(hepG2)。通过稀释培养法最终得到含有重组质粒的稳定细胞系SABCA1。利用这个报告基因为基础的药物筛选系统,筛选了100多种中药提取物。通过荧光素酶活性测试,相对活性达到180%以上的有4种中药提取物,并最终挑选能明显激活ABCA1基因启动子的鬼箭羽水提组分进一步研究,得出半数有效浓度(EC50)为48.06 mg/L。此外,利用基于apoA1基因的药物筛选系统验证得出鬼箭羽水提组分也能促进apoA1基因的表达。     

以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂(热诱导)和抑制剂(EGCG)来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n(pGL-MDR1)∶n(pRL-TK)=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

香樟叶黄酮类化合物的提取及抑菌作用的研究

本文以香樟叶为材料，采用石油醚除脂，乙醇浸提方法，获得黄酮类化合物的提取物．乙醇提取物用Mg＋HCl，Zn＋HCl，1％FeCl3-乙醇液，2％AICl3-乙醇液，1％NaOH进行显色反应，呈现黄酮类化合物性质特征颜色．这提示样品提取物中含有黄酮类化合物．用该提取物对4种细菌，3种霉菌进行抑菌实验．结果表明，提取物具有较强的抗菌活性，且抗菌活性作用呈现明显的量效关系，但对不同菌种的抑菌效果有明显差异．     

吸烟与疾病关系的哲学思考

根据哲学系统论的观点．人体是一个开放的系统，与周围环境发生相互作用。香烟及其烟雾中含有3800多种化合物，其中有毒物质达几百种，至少有43种是致癌物质。但是个体对吸烟的依赖性及吸烟与疾病关系有个体差异细胞。色素（cytochrome，p450）CYP2A6是一种高度多态性基因（已发现10余种等位基因），这种酶主要由肝脏表达．对很多药物和环境中化合物的清除起重要作用。CYP2A6可激活许多结构上非相关的前致癌物．是主要的尼古丁C-氧化酶，CYP2A6与尼古丁的代谢和激活亚硝胺成为最终致癌物密切相关。     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

hKv4.3基因中表达调控序列的研究

为研究hKv4.3基因中功能序列对基因表达的影响,我们将hKv4.3基因转录起始位点上游和下游的部分非编码序列克隆到报告质粒pGL2-Basic vector中,瞬时表达,进行荧光素酶相对活性分析.在hKv4.3基因转录起始位点上游和下游的非编码序列中都具有对基因表达具有抑制作用的功能序列,它们可能在不同的水平上对基因表达产生调节作用.     

羽衣甘蓝黄酮类化合物的提取及其抑菌作用的研究

以羽衣甘蓝（Brassica oleracea varoacephal）茎叶为材料，采用石油醚除脂，乙醇浸提，甲醇溶解方法，获得黄酮类化合物的提取物．甲醇提取物用Mg＋HCl，Zn十HCl，1％FeCl3-乙醇液，2％AlCl3-乙醇液，1％NaOH进行显色反应，呈现黄酮类化合物性质特征颜色．通过紫外吸收光谱法对甲醇提取物进行测定，观测到黄酮类化合物的特征吸收峰带．这提示样品提取物中含有黄酮类化合物．用该提取物对5种细菌，3种霉菌进行抑菌实验．结果表明，提取物具有较强的抗菌活性，且抗菌活性作用呈现明显的量效关系，但对不同菌种的抑菌效果有明显差异．     

降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

利用CRISPR/Cas9双质粒系统构建Nissle 1917ΔcheZ基因缺失株

为研究趋化性基因cheZ对大肠杆菌益生菌Nissle 1917的影响,研究以敲除大肠杆菌Nissle 1917的cheZ基因为目的.首先,利用诺唯赞ClonExpress?MultiS一步克隆试剂盒构建pTargetTΔcheZ重组质粒,随后将pTargetTΔcheZ重组质粒电转入含pCas质粒的Nissle 1917感受态中,以实现对大肠杆菌益生菌Nissle 1917染色体中cheZ基因进行靶向敲除,经PCR鉴定和基因测序双重证实,Nissle 1917基因组中的cheZ基因已敲除.最后,经IPTG诱导和高温培养,消除缺失株中的pTargetTΔcheZ和pCas 2个质粒,最终获得趋化性基因cheZ缺失株Nissle 1917ΔcheZ.本试验为验证cheZ基因在益生菌Nissle1917中的生物活性及其扮演的基因功能的后续相关研究打下了前期基础.     

齐墩果酸氮杂环衍生物合成及对非小细胞肺癌A549作用研究

目的:开展齐墩果酸氮杂环衍生物合成及抗非小细胞肺癌A549作用研究。方法:以齐墩果酸为原料,通过氧化、鲍奇还原胺化、缩合等反应合成齐墩果酸氮杂环衍生物。采用CCK-8试剂盒、流式Annexin V-FITC/PI双染色法和Caspase-3试剂盒分别检测A549细胞的增殖抑制作用、细胞凋亡及Caspase-3的变化。结果:成功合成齐墩果酸氮杂环衍生物3-N-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰基)-齐墩果酸,产率为71.2%。齐墩果酸氮杂环衍生物对A549细胞具有抑制作用且呈量效关系,IC50为110μmol·L~(-1),CC50为146μmol·L~(-1)。齐墩果酸氮杂环衍生物能诱导A549细胞株的凋亡,显著增强A549细胞中Caspase-3的活性。结论:合成的齐墩果酸氮杂环衍生物结构为3-N-(3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酰基)-齐墩果酸,该化合物对A549细胞株具有增殖抑制作用。诱导A549细胞株凋亡与增强Caspase-3的酶活性可能是其机制。     

商陆浆果黄酮类化合物和多糖的提取与测定研究

以商陆浆果为原料,用石油醚去脂-乙醇抽提-甲醇溶解的方法提取了商陆浆果中黄酮类化合物．采用石油醚去脂-热水提取-三氯乙酸法除蛋白-活性炭脱色-乙醇醇析提取、沉淀的提取工艺从商陆浆果中提取多糖,并用苯酚-硫酸比色测定法对其进行定量测定．结果表明：商陆浆果中粗多糖含量为3．77％．用HCl-镁粉、HCl-锌粉热水浴、2％AlCl3-乙醇、1％NaOH溶液和1％FeCl3-乙醇与95％乙醇提取物进行显色反应,呈现黄酮类化合物性质特征颜色;利用紫外分光光度法测定甲醇提取物的紫外吸收光谱,观察到黄酮类化合物的特征吸收峰带,表明样品提取物中含有黄酮类化合物．     

植物细菌诱导型表达载体的构建

根据GenBank中细菌诱导型启动子的碱基序列设计一对引物,通过PCR扩增出启动子PPP3(AF469483,220bp).经分子操作将启动子和质粒pUC18连接后转化E.coliDH5α,经蓝白筛选和PCR检测筛选阳性菌落,测序结果与Genebank中的碱基序列完全相同.对扩增到的PPP3片段和含目的基因(hrap或pflp)的pBI121质粒进行双酶切,分别回收PPP3片段和含目的基因的pBI121大片段,连接后转化E.coliDH5α,通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,表明细菌诱导型启动子和目的基因已正确连接.用重组质粒转化农杆菌,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明植物细菌诱导型表达载体构建成功.     

微生物发酵生产赖氨酸的研究进展

赖氨酸是用发酵法生产的一种人体及动物必需氨基酸,被广泛地用于医药、营养食品和饲料等方面。文章概括了近几年用全球微生物发酵生产赖氨酸的概况,并介绍了由基因重组、基因扩增的方法,包括用可检测识别的染色体DNA重组,利用可检测识别的杂交质粒进行目的基因重组,用PCR技术扩增目标基因的重组等生物技术进行的赖氨酸生产菌株的研究进展。对ε-聚赖氨酸这种新型防腐剂、乳化剂、食疗剂的微生物发酵生产菌的选育及其生产和应用进行了综述。     

肝细胞靶向性Asor-PLL-DNA复合物的构建

目的 :构建肝细胞靶向性Asor PLL DNA复合物。方法 :将携带外源基因的质粒与脱唾液酸糖蛋白结合在一起 ,形成一种可溶性的蛋白 核酸复合物。结果 :该复合物能通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞作用 ,以非病毒感染的方式 ,将外源基因导入肝细胞并得以表达。结论 :和传统的重组病毒介导的基因转移方式相比 ,该复合物具有更高的靶向性、安全性 ,该系统的建立为以肝细胞为靶组织的外源基因介导的肝脏相关疾病的基因治疗提供实验基础。     

融合自杀基因FCU1对结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

目的 构建含融合自杀基因FCU1的重组质粒,经脂质体转染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法 采用分子克隆技术,构建含融合自杀基因FCU1的真核表达质粒pEGFP-FCU1,经脂质体转染结肠癌细胞HCT116,采用MTT法检测前体药物5-FX对HCT116杀伤作用及其旁观者效应.结果 重组质粒pEGFP-FCU1经酶切鉴定,与原始目的 片段大小一致,测序与GenBank中序列一致,转染HCT116细胞后,可见荧光蛋白的表达,前体药物5-FC显示极强的杀伤作用和旁观者效应.结论 FCU1/5-FC自杀基因系统,对结肠癌细胞具有显著的杀伤作用.     

Al-Zr系金属间化合物的第一性原理研究

利用基于密度泛函理论的第一性原理赝势平面波法,计算了Al-Zr系3种金属间化合物在0 K时的生产焓、结合能及相关弹性性能,表征了Al_3Zr、Al_2Zr和AlZr 3种化合物的结构稳定性、硬度和韧/脆性等,并结合总态密度和分波态密度等电子结构分析,揭示了化合物韧/脆性机制。研究表明:Al_3Zr、Al_2Zr和AlZr 3种化合物的结构均具有稳定性,Al_2Zr在所计算的化合物中具有最高硬度,Al_3Zr次之,AlZr最低,且所有化合物均表现为脆性。结合电子结构发现,3种化合物的Al的3s、3p轨道和Zr的4d轨道的价电子具有强烈的杂化作用,从而形成共价键,并导致材料具有低温脆性。     

布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

杆状病毒核心基因ac78的克隆、表达与活性研究

杆状病毒核心基因ac78在杆状病毒的生活周期中具有重要作用。生物信息学分析发现,Ac78与斯氏假单胞菌的细胞色素C氧化酶cbb3-型亚基III具有一定的序列一致性,表明Ac78可能具有氧化酶活性,并在氧化还原反应中具有一定功能。用PCR的方法成功扩增得到ac78基因,该基因序列与GenBank上的苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV) ac78基因的核苷酸同源性100%,将其克隆至原核表达载体p QE30,构建了ac78基因原核表达质粒,转化大肠杆菌M15[pREP4],在1 mmol/L IPTG和低温诱导下超量表达了可溶性的目的蛋白。使用Ni-NTA Resin蛋白纯化树脂获得了较纯的含有6×His接头的Ac78蛋白,使用纯化细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒测定其细胞色素C氧化酶活性,结果为阴性,表明Ac78可能不具有细胞色素C氧化酶活性。上述研究结果为深入探究Ac78的作用机理打下了坚实的基础。     

蜂胶的神奇作用

在植物界,许多树木会分泌出具有抗菌作用的胶状物——树脂,聪明的蜜蜂采集后,便与自己的舌腺等分泌物进行生化作用,便制造出了带有黏性的蜂胶,以粘结加固窝巢。 蜂胶多呈黄褐色,成分复杂。到目前止,科学上测得其含有19类不同化合物,约300种单体物质,其中树脂、香脂约为50％,蜡类30％、芳香油8％、花粉5％。此外还含丰富的氨基酸、酶、维生素和矿物质。这些化合物具有不同的生理、药理作用,主要含有丰富的黄酮类和萜烯化合物。带有特殊香气及生理活性的萜烯类可杀菌