布鲁氏菌Omp16蛋白的原核表达与鉴定

为实现布鲁氏菌Omp16蛋白在大肠杆菌中的高效表达,根据GenBank发表的Omp16(登录号为JF918760. 1)基因序列,在不改变Omp16蛋白氨基酸序列的情况下,根据大肠杆菌密码子偏好性优化基因序列,全基因合成Omp16基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)-Omp16,转化至BL21工程菌进行诱导表达,利用His-tag镍柱纯化Omp16重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a (+)-Omp16/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0. 5 mmol/L诱导6 h时,Omp16蛋白表达量最高; SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后Omp16蛋白达到了电泳纯,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在21ku处出现阳性条带,与预期蛋白分子大小相符,因此成功在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达出布鲁氏菌Omp16重组蛋白,为后续单克隆抗体的制备和布鲁氏菌病的检测试剂的研发提供了参考。     

Arthrobacter globiform is酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

大肠杆菌核苷磷酸化酶的重组表达和活性

将大肠杆菌K-12菌株来源的嘌呤核苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和胸苷磷酸化酶基因分别克隆到pET-11a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌表达,通过SDS-PAGE分析和酶的活性测定,重组菌诱导表达后目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的37%以上,与产核苷磷酸化酶的野生菌比较,酶的活性也有显著提高。在特异反应条件下,构建的工程菌可以用来高效催化核苷的转糖基反应。     

产冷活性淀粉酶嗜冷菌的分离和纯化

文章主要对产冷活性淀粉酶的冷适应微生物进行分离和纯化。通过对菌株的分离和提取基因组DNA进行PCR扩增得到其16S rRNA基因后连接于T—载体再转入大肠杆菌JM109中,筛选阳性克隆转化子进行培养,最后提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。     

通用干扰素与胸腺肽融合基因构建与表达研究

临床上将干扰素(IFN)和胸腺肽(THYα1)联合使用远大于各自单独使用的效果,根据细胞因子协同作用的特点,本文通过DNA重组技术将两者构成一个融合基因。本实验用PCR技术将化学合成的胸腺肽α1基因与干扰素基因通过PCR拼接、扩增并克隆到PGEM-T载体中,构建克隆质粒PGEM-IFNTHY。为使IFNTHY基因在原核细胞中表达,克隆质粒经酶切、插入到表达载体pET28 a中。将重组质粒转化至表达宿主BL21(DE3)中,经诱导,SDS-PAGE和W esterb lot检测显示,pET28 IFNTHY基因得到了表达;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示表达产物有活性。     

两株野生型枯草杆菌α-淀粉酶基因的克隆和测序

从土壤中筛选得到两株产α-淀粉酶的枯草杆菌QSH4株和SHX6株.根据枯草杆菌168株的淀粉酶基因设计引物,对QSH4、SHX6株的α-淀粉酶基因进行了克隆及测序.结果表明两株菌的α-淀粉酶基因碱基数目相等,均为1948bp.两者的碱基序列具有99.90%的同源性.QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶基因碱基均较168株酶基因缺失了35 bp(靠近3'-端),另有28个位点的碱基不同,与枯草杆菌168株α-淀粉酶基因之间有96.97%的同源性.由淀粉酶基因测序结果推测QSH4株和SHX6株的α-淀粉酶蛋白由477个氨基酸组成.与168株的α-淀粉酶蛋白(660个氨基酸)相差183个氨基酸.由此推断酶活性中心可能位于酶分子的N-端的3/4肽段.     

核黄素受体蛋白的原核融合表达

用PCR(polymerase-chain-reaction)方法从含有软体海龟编码核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein,RfBP)基因的质粒中克隆出RfBP基因,将该基因与原核表达载体pET30a( )重组并研究了表达条件,聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳表明,蛋白质的大小为35 kD,以BL21(DE3)pLysS作宿主菌,1 mmol/LIPTG(isopropyl-l-thio-β-D-galactoside)诱导4h,融合蛋白His-tag-RfBP表达量达到最大.本文研究结果可为研究核黄素受体蛋白调节植物的核黄素含量及生长发育机制奠定基础.     

降钙素原的原核表达及鉴定

为了实现降钙素原(PCT)蛋白在大肠杆菌中高效表达,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其克隆到p ET28a(+)载体中,构建重组质粒p ET28a(+)/PCT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中。将IPTG作为诱导剂诱导重组蛋白的表达,利用His-tag镍柱纯化PCT重组蛋白,并对纯化后的PCT重组蛋白进行SDS-PAGE电泳分析以及Western blot鉴定。结果表明:当重组菌株的诱导条件为0.5 m M IPTG 25℃诱导12h时,PCT蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳显示:纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上。Western blot显示:在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达PCT蛋白,为后续开展PCT单抗的制备以及检测方法的研究奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.     

利用CRISPR/Cas9双质粒系统构建Nissle 1917ΔcheZ基因缺失株

为研究趋化性基因cheZ对大肠杆菌益生菌Nissle 1917的影响,研究以敲除大肠杆菌Nissle 1917的cheZ基因为目的.首先,利用诺唯赞ClonExpress?MultiS一步克隆试剂盒构建pTargetTΔcheZ重组质粒,随后将pTargetTΔcheZ重组质粒电转入含pCas质粒的Nissle 1917感受态中,以实现对大肠杆菌益生菌Nissle 1917染色体中cheZ基因进行靶向敲除,经PCR鉴定和基因测序双重证实,Nissle 1917基因组中的cheZ基因已敲除.最后,经IPTG诱导和高温培养,消除缺失株中的pTargetTΔcheZ和pCas 2个质粒,最终获得趋化性基因cheZ缺失株Nissle 1917ΔcheZ.本试验为验证cheZ基因在益生菌Nissle1917中的生物活性及其扮演的基因功能的后续相关研究打下了前期基础.     

转AtMYB44基因小麦的获得和检测

为了评价拟南芥转录因子AtMYB44基因对小麦抗病能力的影响,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)基因作为选择标记,通过基因枪介导法将带有At-MYB44基因的表达质粒AF234296-44导入小麦品种扬麦158.经过2～3次甘露糖筛选后,获得75株再生苗.通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色获得40株CPR阳性再生苗,进一步通过标记基因PMI和目的基因AtMYB44的PCR检测,获得22株PCR阳性植株,转化率为0.306%.结果初步表明AtMYB44基因已整合到小麦基因组中,获得了生物安全标记的转AtMYB44基因小麦.     

基因替换及多基因共表达强化大肠杆菌辅酶Q_(10)的合成能力

为了强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力,对大肠杆菌进行了相关的基因操作。通过敲除大肠杆菌染色体上的聚八异戊二烯焦磷酸合成酶基因ispB,并导入来自Gluconobactersuboxydans的聚十异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA,使大肠杆菌具有CoQ10合成能力的同时降低了内源性辅酶Q8(CoQ8)的合成。采用双质粒共表达系统,对CoQ生物合成途径中多个功能基因进行了强化表达,构建得到的重组大肠杆菌CoQ的合成能力、CoQ10合成的专一性都有明显改善,其中ubiCA和ddsA基因的协同表达效果最为明显,CoQ的合成能力比对照提高了65%,而CoQ10的合成量也提高了1.1倍。     

葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响

采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLMVL 2EGF]生产人表皮生长因子(hEGF),其中hEGF表达由PL启动子控制并通过phoA信号肽分泌到胞外。实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF的表达和分泌有很大影响。当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g.h)时,hEGF表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196 g/(g.h)时,单位菌体产生的hEGF水平最高(121.6 m g/g),其中分泌至胞外的hEGF占42%。此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF的生产速率。     

链霉菌查尔酮合成酶基因克隆及原核表达载体构建

根据Genbank数据库已知的链霉菌的查尔酮合成酶基因的保守区设计chs基因特异简并引物,土壤总DNA为模板,利用PCR技术扩增得到该l条chs基因编码区,通过TA克隆、测序和同源比对及进化分析表明:该基因为放线菌来源chs基因.分别在该基因5’末端和3’末端分别引入的限制酶NcoI和EcoR I酶切位点,利用上述2种限制酶分别酶切导入到psimple-T/chs载体和原核表达pET32a,凝胶回收目的片段后,将二者连接并转化大肠杆菌感受态细胞,转化子经菌液PCR筛选、双酶切鉴定后,3730测序结果表明,该基因全长编码区为1089 bp,推测该基因编码全长为362个氨基酸残基,等电点(PI)为5.41、分子量为3 965道尔顿含有CHS保守功能区的酸性蛋白质.分析表明,该基因与Streptomyces lividans来源的查尔酮合成酶RppA基因核苷酸相似性高达93％,氨基酸序列相似性高达87.70％.测序结果表明,该基因已经成功插入到pET32a载体中.     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolorA3(2),Streptomyces maritimus,Streptomyces mycarofaciensATCC 21454和Streptomycessp.Tü4128)中分别被克隆。测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性。将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生。将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9。     

鸭死胚细菌分离及消毒剂抑菌试验

从发病严重的三个孵房抽取死鸭胚120枚,进行细菌分离,96枚中分离到137株细菌,其中大肠杆菌64株占47％,克雷伯氏杆菌47株占34％,此外还有产气杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌共计26株,占19％。用分离的大肠杆菌和克雷伯氏杆菌涂布10日龄鸭胚蛋壳接种,可分别引起30％(3/10)和40％(4/10)胚胎死亡。结果表明:荣昌县鸭胚大量死亡的原因主要是细菌感染。本文还报道了4种消毒药对分离菌株的抑制试验结果。     

老年人和儿童社区获得性肺炎的病原学分析

目的探讨儿童和老年人社区获得性肺炎病原学差异。方法回顾性分析我院236例社区获得性肺炎患者的临床资料,比较病原体种类和比例差异。结果所有入组的236例患者均行痰培养和病原体检测。儿童组106例患者中检出痰培养阳性102例,共计108株病菌,其中肺炎链球菌50株(46.3),金黄色葡萄球菌23株(21.3),流感嗜血杆菌17株(15.7),大肠杆菌11株(10.2),呼吸道合胞病毒5株(4.6),其他病原体2株(1.9)。老年人组130例患者中检测痰培养阳性119例,共计131株病菌,其中肺炎链球菌67株(51.1),G-阴性杆菌54株(41.2,包括克雷白杆菌25株,大肠杆菌21株,流感嗜血杆菌8株),军团菌6株(4.6),其他病原体4株(3.1)。结论儿童社区获得性肺炎的病原体以肺炎链球菌最为常见,占46.3,其次为金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌和呼吸道合胞病毒;老年人社区获得性肺炎的主要病原体包括肺炎链球菌和G-阴性杆菌,其他病原体较少见。     

STAT2,STAT3,IL12RB2,JAK2基因与强直性脊柱炎患病风险的关联研究

目的探索STAT2基因(rs2066808,C;rs2066807,G),STAT3基因(rs744166,C),IL12RB2基因(rs3790567,A;rs3790568,A)和JAK2基因(rs10758669,A)与强直性脊柱炎(AS)的关系,及6个SNP位点之间是否存在交互作用。方法通过对吉林汉族人群的48名患者与55名正常人收集的血液DNA,进行基因分型,建立基因型数据库,采用遗传学非参数分析方法,进行病例-对照分析和单纯病例分析各基因与中国人群AS患病风险的关联。采用SHEsis软件进行单倍型分析。应用MDR方法进行基因-基因交互作用分析。结果①STAT2基因(rs2066808,C;rs2066807,G),STAT3基因(rs744166,C),IL12RB2基因(rs3790567,A;rs3790568,A)和JAK2基因(rs10758669,A)与强直性脊柱炎(AS)关联分析显示各基因的风险等位基因和基因型频率在病例组和对照组间的分布差异无显著性(P>0.05)。②IL12RB2基因上rs3790567,rs3790568的单倍型分析,分析结果无统计学意义(P-exact>0.05)。③STAT2基因(rs2066808,C;rs2066807,G),STAT3基因(rs744166,C),IL12RB2基因(rs3790567,A;rs3790568,A)和JAK2基因(rs10758669,A)的6个多态性位点的交互作用表明,最佳模型包含了rs2066808,rs3790567,rs744166,rs107586669这4个位点,模型的P<0.0001,交叉验证一致性为10/10,检验样本的准确度为0.7032,结果提示STAT2,STAT3,IL12RB2和JAK2基因之间可能存在基因-基因交互作用。节点图说明STAT3基因与JAK2基因之间距离更短,有最强的协同作用。结论 STAT2基因(rs2066808,C;rs2066807,G),STAT3基因(rs744166,C),IL12RB2基因(rs3790567,A;rs3790568,A)和JAK2基因(rs10758669,A)与强直性脊柱炎(AS)关联分析显示各基因的风险等位基因和基因型频率在病例组和对照组间的分布差异无显著性(P>0.05)。四个基因之间存在交互作用。     

原位杂交技术在植物研究中的应用

原位杂交是近年来快速发展起来的一门新技术。该技术在植物研究中的应用越来越广泛 ,主要包括以下几个方面 :(1)特定DNA序列的定位 ,即基因的物理作图 ;(2 )杂种中亲本染色体的鉴定 ;(3)物种进化及亲缘关系探讨 ;(4)基因组的结构、组成及在细胞中的空间排列 ;(5 )遗传转化材料的分析等